不同氮利用效率小麦品种TaNRT_TaNPF家族基因表达特点.pdf
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1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2023,49(11):29662977 http:/zwxb.chinacrops.org/ISSN 0496-3490;CN 11-1809/S;CODEN TSHPA9 E-mail: 本研究由国家自然科学基金项目(32071956)资助。This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(32071956).*通信作者(Corresponding authors):王小纯,E-mail:;张志勇,E-mail: 第一作者联系方式:
2、E-mail: Received(收稿日期):2022-09-13;Accepted(接受日期):2023-04-17;Published online(网络出版日期):2023-05-16.URL:https:/ This is an open access article under the CC BY-NC-ND license(http:/creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).DOI:10.3724/SP.J.1006.2023.21063 不同氮利用效率小麦品种 TaNRT/TaNPF 家族基因表达特点 王露露1 仪子博1 王浩哲1
3、能芙蓉2 马新明1 张志勇1,*王小纯1,2,*1省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室/河南农业大学,河南郑州 45000;2河南农业大学生命科学学院,河南郑州 450002 摘 要:氮素是小麦生长发育的必需元素之一,NO3-N 是小麦从土壤中获取氮的主要形式。NRT/NPF 家族基因编码膜转运蛋白,主要参与植物 NO3-N 吸收、运输及分配。为了解小麦 NRT/NPF 家族基因与氮素利用的关系,选用氮高效小麦品种周麦 27(ZM27)和氮低效品种矮抗 58(AK58),利用二代测序技术,研究了不同氮水平(N120、N225、N330)开花期 TaNRT/TaNPF 家族基因在旗叶中的表达特点
4、。结果表明,二代测序鉴定到 386 个 TaNRT/TaNPF 家族基因;与 AK58 相比,ZM27 在氮减量(N120)、正常(N225)、过量(N330)条件下差异表达基因分别为 27、16 和 23 个,上调表达基因分别为 16(59.26%)、12(75%)和 19(82.61%)个;减氮条件下 ZM27 有 7 个特异下调表达基因,氮过量条件下 TaNPF8.1 表达量最高,且显著上调 1.5 倍。可见,TaNRT/TaNPF 家族基因表达水平受施氮量及品种调控。利用小麦网络数据库分析发现 TaNRT/TaNPF 家族基因表达具有组织特异性及染色体偏好性,旗叶表达量最高的TaNPF
5、8.1 定位于 3A 染色体,根系特异表达的 TaNRT2.2 和 TaNRT3.1 主要分布于 6 号染色体,茎秆特异表达的TaNPF4.5 主要分布在 2 号染色体。qRT-PCR 分析显示 TaNRT/TaNPF 基因表达特点与二代转录组及网络数据结果一致。TaNPF8.1、TaNPF4.5 和 TaNRT3.1 蛋白互作分析发现,NO3-N 转运可能还需要转录因子 MYB、叶绿素 A-B 结合蛋白、伴侣蛋白等协同参与,为进一步研究 TaNRT/TaNPF 家族表达与氮素吸收利用的关系奠定了基础。关键词:小麦;NRT/NPF;氮效率;差异表达;组织特异性 Gene expression
6、characteristics of TaNRT/TaNPF family in wheat cultivars with different nitrogen efficiency WANG Lu-Lu1,YI Zi-Bo1,WANG Hao-Zhe1,NAI Fu-Rong2,MA Xin-Ming1,ZHANG Zhi-Yong1,*,and WANG Xiao-Chun1,2,*1 Co-constuction State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science,Henan Agricultural University,Zheng
7、zhou 450002,Henan,China;2 Department of Biochemistry,College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,Henan,China Abstract:Nitrogen is one of the essential elements for wheat growth and development,and NO3-N is the main form of nitrogen that wheat obtains from soil.NRT/NPF gene
8、s family encode membrane transporters,which are mainly involved in NO3-N ab-sorption,transport,and allocation in plants.In order to understand the relationship between NRT/NPF family and nitrogen utiliza-tion in wheat,the relative expression characteristic of TaNRT/TaNPF family in flag leaves of N-e
9、fficient wheat cultivars Zhoumai 27(ZM27)and N-inefficient wheat cultivars Aikang 58(AK58)at flowering stage were studied with the second-generation se-quencing technology.The results showed that 386 genes of TaNRT/TaNPF family were identified in the second generation tran-scriptome database.Compare
10、d with AK58,there were 27,16,and 23 differentially expressed genes in ZM27 in reducing(N120),normal(N225),and excessive(N330)nitrogen treatments.There were 16(59.26%),12(75%),and 19(82.61%)up-regulated genes in ZM27,respectively.Seven genes were down-regulated in ZM27 in reducing nitrogen treatment.
11、The relative expression level of TaNPF8.1 was the highest and significantly up-regulated by 1.5 times in nitrogen excessive condition.In conclusion,the relative expression of TaNRT/TaNPF family genes was regulated by nitrogen application rate and cultivar.Wheat network data-base showed that the rela
12、tive expression of TaNRT/TaNPF family had tissue specificity and chromosomal preference.The highest 第11期 王露露等:不同氮利用效率小麦品种 TaNRT/TaNPF 家族基因表达特点 2967 expression level of TaNPF8.1 in flag leaf was located on chromosome 3A,and the root specific expression TaNRT2.2 and TaNRT3.1 were mainly distributed on
13、 chromosome 6.The stem specific expression of TaNPF4.5 was mainly distributed on chro-mosome 2.The qRT-PCR of TaNRT/TaNPF genes were consistent with the results of the second-generation transcriptome and network data.Interaction analysis of TaNPF8.1,TaNPF4.5,and TaNRT3.1 revealed that NO3-N transpor
14、t may also require the collaborative participation of transcription factor MYB,chlorophyll A-B binding protein,and chaperone protein.These findings laid a foundation for further studies on the relationship between TaNRT/TaNPF family expression and nitrogen uptake and utilization.Keywords:wheat;NRT/N
15、PF;nitrogen use efficiency;different expression;tissue specificity 氮素是小麦生长发育过程中必需的大量元素之一,是小麦产量与品质形成的重要限制因素1。硝态氮(NO3-N)和铵态氮(NH4+-N)是植物的两种无机氮源2,小麦无机氮吸收转运以 NO3-N 为主3-4。根系吸收的 NO3一小部分直接同化以支持生长,大部分通过茎杆运输到叶片中同化或储存于液泡中供以后使用,完成这些过程需要植物有效地感知外部氮素供应水平,并且通过代谢酶和转运体调节不同组织的氮需求2。植物体内参与 NO3转运的家族包括 NPF(Ni-trate transp
16、orter 1(NRT1)/Peptide transporter(PTR)family)、NRT2(Nitrate transporter 2)、NRT3(Nitrate transporter 3)、CLC(Chloride channel family)和SLAC(Slowly activating anion channel)5-6。NPF 分为 NPF1-NPF8 亚家族,包括低亲和力的硝酸盐转运体、双亲和力硝酸盐转运体及多肽转运体7。大多数NPF转 运 体 为 低 亲 和 力 硝 酸 盐 转 运 体,AtNPF6.3/NRT1.1/CHL1 和 OsNPF6.5/OsNRT1.1b
17、 对NO3具有双重亲和力8。NRT2 和 NRT3 为高亲和力的硝酸盐转运体9。氯离子通道蛋白(CLC)主要转运Cl,也转运分子量相近的 NO3;慢阴离子通道蛋白(SLAC)主要在植物阴离子(Cl、NO3等)摄取和气孔开闭过程中起到重要作用10。植物 NO3吸收转运主要由 NRT/NPF 家族完成。NRT/NPF 家族不同成员组织定位不同,功能也不尽相同。在拟南芥中,只有 AtNRT2.7 定位于种子液泡膜外11,其他 AtNRT2 成员均定位为根系,参与根系 NO3的吸收,缺氮诱导 AtNRT2.5 表达12。AtNRT3 定位于根系,是一种高亲和力 NO3转运体,还可以促进 NRT2.1
18、的转运活性13。AtNPF1 定位于展开叶主脉的伴胞中,参与 NO3向幼叶的分配14。AtNPF2 分布于拟南芥根系、叶片、花药及花丝等部位,参与根系韧皮部 NO3装载15、盐胁迫下根-茎NO3转运16、根系 NO3外流12以及再分配等17。AtNPF3 定位于叶片次脉、下胚轴、花药与花丝交界处及根内皮层,与叶片中 NO3积累有关18。AtNPF4定位于根毛和根表皮,参与 NO3吸收19。AtNPF5定位于拟南芥根系和叶片维管束,参与液泡 NO3外排20。AtNPF6 主要参与根系 NO3转运6。AtNPF7参与木质部 NO3转运21。AtNPF8 与根系小肽吸收密切相关22。OsNPF2 定
19、位于根表皮、根木质部薄壁组织,参与根冠 NO3摄取、转运和远距离运输23-24。OsNPF6 定位于水稻根毛、根表皮及维管组织,决定不同品种水稻的 NO3利用效率25。OsNPF7定位于根厚壁组织、皮层、侧根、茎及花柱,参与细胞内及各组织间 NO3分配26。OsNPF8.1 则调节二甲基砷酸盐在叶、节、根中的积累27。根系可感知外界 NO3浓度并调节侧根及根毛发育,氮浓度也可作为信号调控植物体地上与地下部的含氮物质运输28。小 麦 NRT/NPF 基 因 家 族 庞 大,包 括 NPF(NPF1-NPF8)亚家族8、NRT2 和 NRT3,前人研究表明小麦 NPF 基因表达受施氮和发育的调控5
20、,但与氮代谢相关功能研究较少,与小麦氮素利用效率相关的分子机制尚不明确。小麦旗叶与产量形成关系密切,开花期旗叶 NO3积累为后期灌浆过程含氮化合物向籽粒运输提供物质基础29。因此,本试验以不同氮处理(N120、N225 和 N330)的氮高效品种周麦 27(ZM27)和氮低效品种矮抗 58(AK58)开花期旗叶为材料,通过二代测序分析氮处理对不同氮效率小麦品种 NRT/NPF 家族基因表达的影响,并利用网上数据库分析 NRT/NPF 基因家族在小麦不同组织器官中的表达特点,为进一步深入研究小麦 NO3吸收、转运、分配、同化分子机制奠定基础,也为氮肥减量及氮高效率小麦品种选育提供理论依据。1 材
21、料与方法 1.1 试验材料 于 2018 年 10 月 16 日滑县试验农场大田播种,播种行距 20 cm,基本苗 375 万株 hm2。试验品种是课题组在执行国家自然基金(31271650,20122016年)时,从河南省近 10 多年来推广的 30 个小麦品种中筛选的典型氮高效品种周麦 27(ZM49)和氮低效品种矮抗 58(AK58)。20132019 年连续 6 年大田 2968 作 物 学 报 第 49 卷 试验显示 2 个品种的氮效率在不同生态类型区表现稳定,氮效率差异显著。土壤类型为潮土,含水量14.65%。小麦播种前土壤基础养分含量为:有机质20.53 g kg1、全氮 1.0
22、1 g kg1、全磷 1.96 g kg1、全钾 8.43 g kg1、速效磷 55.3 mg kg1、速效钾 382.85 mg kg1、硝态氮 17.83 mg kg1、铵态氮 13.85 mg kg1。试验小区长 16 m,宽 7.5 m,每个小区设 3 个重复。设置 3 个施氮处理,即减氮 120 kg hm2(N120)、正常氮 225 kg hm2(N225)、过量氮 330 kg hm2(N330),P2O5和 K2O 各 225 kg hm2。肥料在播种前一次施入,其他管理同一般高产大田。于小麦开花期选取长势均匀一致的旗叶,每个处理重复 3次,液氮处理后于80冰箱保存,用于二代
23、转录组测序。花后 16 d 选取 N120 和 N225 处理下长势均匀一致的植株用铁锹连根挖出(深 40 cm),用剪刀剪掉所有根系并清洗干净,地上部取籽粒(穗中部饱满的籽粒)、旗叶、旗叶鞘、茎(穗下节),液氮处理后于80冰箱保存,用于 qRT-PCR 检验。1.2 二代测序 将上述样品分别于液氮中研磨成粉状,将开花期旗叶样品送百迈客生物科技公司提取 RNA 并测序。用 TRIzol 试剂(Thermo Scientific,美国)提取总RNA,用安捷伦 RNA 6000 纳米试剂盒及安捷伦2100 生物分析仪分析 RNA 完整性(Agilent Tech-nologies,美国)30,用
24、NEBNext Ultra RNA 试剂盒Illumina(New England Biolabs,美国)建立测序文库,用 IlluminaHiSeq 4000 平台(Illumina,美国)进行双 末端测序,生成 150 bp 长的 reads31。通过删除接头及含 ploy-N 的低质量 reads,从原始数据中获得约82,011,596个可信reads。用TopHat v2.0.12将这些reads比对到 Ensembl Genomes(fttp:/ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release32/fasta/triticum_aestivum/cd
25、na/Triticum_aestivum.TGACv1.cdna.all.fa.gz;release32)的中国春小麦的 cDNA 数据库中(http:/ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)30。共获得 78,319 个转录本,其中 24,607 个(31.4%)来自 A 基因组,25,573 个(32.7%)来自 B 基因组,24,952 个(31.9%)来自 D 基因组,3187 个(4.1%)来自未知染色体组。通过下式计算相对表达量。Total exon fragmentsFPKMReads(millions)Exon lengt(kb)1.3
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