UPLC-MS_MS同时测定畜禽粪便中19种喹诺酮类抗生素残留量.pdf
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1、NO.172023饲料研究FEEDRESEARCH113检测技术分UPLC-MS/MS同时测定畜禽粪便中19种喹诺酮类抗生素残留量张敏1行徐宜宏?张彤?付海滨2*王素华3刘立兵4薛志平1魏欢欢!(1.沈阳农业大学工程学院,辽宁沈阳110 8 6 6;2.沈阳海关技术中心,辽宁沈阳110 0 16;3.温州海关综合技术服务中心,浙江温州32 50 2 7;4.石家庄海关技术中心,河北石家庄0 50 0 51)摘要:试验旨在建立1种QuEChERS前处理与超高效液相色谱-串联质谱联用的同时测定畜禽粪便中19种喹诺酮类抗生素残留的分析方法。使用乙睛(含5%甲酸)作为提取液提取畜禽粪便,QuEChER
2、S净化,甲醇+0.1%甲酸水作为流动相,UPLC-MS/MS确证检测,外标法定量。结果显示,使用优化后的方法对畜禽粪便样品检测,该方法检出限为0.15 0.6 0 ug/kg,定量限为0.5 2.0 ug/kg,回收率6 1.3%92.8%,相对标准偏差3.2%9.7%。研究表明,此方法方便快捷,定量限低,稳定性好,适用于畜禽粪便中19种喹诺酮类抗生素的检测。关键词:喹诺酮类抗生素;液相色谱串联质谱;畜禽粪便;QuEChERS中图分类号:S816.17文献标识码:A文章编号:10 0 2-2 8 13(2 0 2 3)17-0 113-0 5Doi:10.13557/ki.issn1002-2
3、813.2023.17.022Determination of 19 quinolone antibiotics residues in livestock manure by UPLC-MS/MSZHANG MinXU Yi-hongZHANG TongFU Hai-binWANGSu-huaLIU Li-bingXUE Zhi-pingWEIHuan-huanAbstract:The study was to develop a QuEChERS pretreatment method combined with UPLC-MS/MS for simultaneousdeterminati
4、on of 19 quinolone residues in livestock and poultry feces.The animal feces were extracted by acetonitrile(containing 5%formic acid),purified by QuEChERS,methanol+0.1%formic acid water as the mobile phase,confirmedby UPLC-MS/MS,and quantified by external standard method.The results showed that the d
5、etection limit of theoptimized method was 0.150.60 g/kg,the limit of quantification was 0.52.0 g/kg,the recovery rate was 61.3%92.8%,and the relative standard deviation was 3.2%9.7%.The experiment indicates that the method is convenient,rapid,low limit of quantification and good stability,and it is
6、suitable for the detection of 19 kinds of quinolone residues inlivestock and poultry feces.Key words:quinolone antibiotics;UPLC-MS;livestock manure;QuEChERS随着人们对食品安全的日益关注,加强畜禽类食品安全检测具有重要意义。喹诺酮类化合物具有抗菌活性强、范围广、副作用低等特点,广泛应用于畜牧业、水产等养殖业中11-2。但动物通过食物和其他方法获得的抗生素无法被身体完全吸收,30%90%的抗生素与动物粪便一同排出体外,导致抗生素在畜禽粪便中残留
7、3-4。研究表明,畜禽粪便可被加工制成有机肥料还田,如猪粪可加工成家禽饲料或应用于沼气发电等方面5-7 1。但畜禽第一作者:张敏,博士,副教授,研究方向为农业废弃物无害化处理及资源化利用。通信作者:付海滨,博士,研究员。基金项目:国家自然科学基金项目(项目编号:3140 0 442);辽宁省自然科学基金项目(项目编号:2 0 2 3-MS-213);沈阳市科学技术计划项目(项目编号:2 1-10 8-9-37)收稿日期:2 0 2 3-0 4-2 9粪便中含有的抗生素类药物仍存在活性,其最终的代谢产物会随着其产品如肥料和饲料等再次进入环境以及动植物体内,进而给人类带来直接或间接的危害8-10
8、。据统计,我国目前年产畜禽粪污已超过2 40 亿t(,且总量一直在稳定增长中。因此,检测畜禽粪便中抗生素残留具有重要意义。目前,国内外关于喹诺酮类药物的检测,普遍为牛奶、动物组织、婴幼儿食品等可食性样品,而关于畜禽动物抗生素水平的体外检测报道较少,且检测种类不全12-13。基于此,本试验建立了一种有效的液相色谱-串联质谱分析方法,可同时测定畜禽粪便中19种喹诺酮的残留量,以期为后期畜禽粪便的安全再利用提供参考。1材料与方法1.1仪器与试剂主要仪器:UPLC-MS/MS-8060超高效液相色谱串联质谱仪(日本岛津公司)、GeniePURISTTOC超纯水NO.172023饲料研究FEEDRESE
9、ARCH114检测技术系统(上海乐枫生物技术有限公司)、GX-271固相萃取仪(美国Supelco公司)、BSA2202S电子天平(德国赛多利斯公司)、MGS-2200氮吹仪(东京理化公司)、X1离心机(德国赛默飞世尔公司)、MX-S涡混仪(北京大龙仪器有限公司)。主要试剂:氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、双氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、嗯喹酸、氟甲喹、司帕沙星、达氟沙星、氟罗沙星、马波沙星、依诺沙星、奥比沙星、吡哌酸、洛美沙星、西诺沙星、萘啶酸标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer,纯度96%。色谱纯乙腈、色谱纯甲醇、色谱纯甲酸、QuEChERS净化盐包(5.0 g无水硫酸镁、
10、2.50 gC18、2.50 g Ca r b)、0.2 2 m滤膜均购自美国迪马公司。1.2样品制备沈阳周边的农场采集适宜的畜禽粪便于50 0 mL具塞锥形瓶中,-18 避光密封保存。1.3样品提取与净化1.3.1样品的提取称取2 g(精确至0.0 1g)样品,于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈(含5%甲酸),均质40 s,0 4、10000r/min离心10 min,使用10 mL乙腈(含5%甲酸)重复提取1次,合并上清液。1.3.2样品的净化将上清液加入QuEChERS净化盐包的离心管中,涡旋混匀。0 4、10 0 0 0 r/min离心10 min。准确吸取上清液5.0 mL,氮
11、吹至近干,使用流动相溶液溶解残渣,过0.2 2 m滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。1.4样品分析1.4.1色谱条件色谱柱为岛津Cig(10 0 m m 2.1m m,2.0 m),样品室温度为4,柱温为40,进样体积为2.0 L,流速为0.30 mL/min。流动相梯度为甲醇(A)和0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱0 2 minB保持95%;2 12 minB由9 5%变化至5%;12 13minB保持5%;13 14minB由5%变化至95%;14 16 minB保持95%。1.4.2质谱条件离子源为ESI+,D L 温度为2 50,加热块温度为400,接口温度为30 0,接口电压为3.
12、0 kV,雾化气流量为3.0 L/min,干燥气流量为10.0 L/min,加热气流量为10.0 L/min。2结果与分析2.1色谱条件的优化结果2.1.1流动相的选择优化结果本试验对比了有机相(甲醇和乙腈),水相(水、5mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸、含0.1%甲酸的5mmol/L乙酸铵水溶液)的不同组合对19种喹诺酮的分离度的影响。结果表明,甲醇+0.1%甲酸水溶液作为流动相时,19种喹诺酮经梯度洗涤完全分离且具有更好的峰值形状和更高的灵敏度。因此,选择甲醇+0.1%甲酸水溶液作为流动相。此流动相条件下,19种喹诺酮类药物的保留时间和MRM图见图1。20.01.氧氟沙星36 2 2 0
13、0 0 318.2 0 0 0+)CE:-18.07.沙拉沙星38 6.2 0 0 0 36 8:10 0 0(+)CE:-20.01.氟沙星36 2 2 0 0 0 2 6 1.10 X0(+)CE:-2 8:0)7沙拉沙尾38 6.2 0 0 2 99.10 0 0+)CE-25.015.奥比沙星396.0 0 0 0 2 95.0 0 0 0+)CE:-25.017.52.诺氟沙星32 0.2 0 0 0 30 2.10 K00X+)CE:-20.08.嗯毫酸2 6 2.10 0 0 2 14.10 0 0+)CE-18.016.派凌30 4.2 0 0 0 2 0 6.10 H+)CE
14、:-18.0)2.诺氟沙星32 0.2 0 0 0 2 31.10 0 0(+)CE:-46.08.嗯喹酸2 6 2.10 0 0 2 16.0 0 0 0(+)CE:-32.016.此派酸30 1.2 0 0 0 2 15.10 0(+)CE:-38.015.03.培氟沙星331.2 0 0 0 316.2 0 0 0(+)CE:-20.09氟甲隆2 6 2.30 0 2 14.10 0 0+JCE:-16.017.洛美沙星10 0 0 0 0 0 0.0 0 0 0+)CE-35.03.培氟沙星334.2 0 0 0 2 90.10 0 0(+)CE:-16.09.氟甲喹2 6 2.10
15、0 0 2 0 2.0 0 0 0(+)CE:-36.01=.洛美沙星352.2 0 0 0 2 6 5.0 M000+)CE:-2 2.012.54.环内沙星332 2(0 0 14.10 0+10 E-16.010,司中沙星30 30 0 349.0(+)CE:-210501/刺4环内沙星332.2 0 0 0 2 31.0 0 0 0+CE-41.0J0,可1沙星393.0 HMH292.0000+)CE:-21018.西诺沙星2 6 3.10 0 0 2 45.10 0 0+)CE:-16.05双氟沙星4K03.50.000+)C E-2 0.01达威沙星3 58 2 0 0 0 3
16、10+C1-20.018.西诺沙星2 6 3.10 0 0 18 9.0 0 0 0(+)CE:-30.010.05.双氟沙星40 0.0 0 0 0 2 99.0 0 0 0(+)CE:-29.011.达氟沙星358.2 0 0 0 2 55.0 0 0 0(+)CE:-42.019.茶啶酸2 33.10 0 M215.1000(+)CE:-14.019.茶啶酸2 33.10 0 0 18 7.0 0 0+)CE:-28.07.56.恩诺沙星36 0.30 0 0 316.2 0 0 0(+)CE:-20.012.氟罗沙星37 0.0 0 0 2 6 9.0 0 0 0(+)CE:-28.0
17、13.马波沙星36 3.10 0 0 32 0.0 0 0 0(+)CE:-15.05.013.马波沙星36 3.10 0 0 3-45.0 0 0 0(+)CE:-20.614.依诺沙星32 1.2 0 0 0 30 3.10 0 0(+)CE:-20.02.514.依诺沙星32 1.2 0 0 0 2 0 3.90 0 0(+)CE:-48.0012345678910111213141516时间/min图119种喹诺酮类药物的保留时间和MRM图2.1.2质谱条件的优化结果对19种浓度为0.1g/mL的喹诺酮的单标标准液进行全扫描,根据峰高、峰形以及信噪比等因素确定母离子、定性离子和定量离子
18、,在MRM模式下,对Q1PreBias、Q3PreBias、和CE进行优化参数,确定质谱参数,结果见表1。2.2前处理条件的优化结果2.2.1提取溶剂的选择喹诺酮类药物在酸性条件下更加稳定。本研究比较了在乙腈中加入不同水平甲酸作为提取溶剂时19种喹诺酮的回收率,结果见表2。由表2 可知,随着提取溶剂中甲酸含量增加,19种喹诺酮的回收率也逐步提升,当提取溶剂中甲酸含量增加至10%时,19种喹诺酮回收率为6 6.4%10 0.1%,提取溶剂中甲酸含量为5%时,19种喹诺酮的回收率7 0.2%107.1%,与甲酸含量为10%相差较小。因此,本研究采用乙腈(含有5%甲酸)作为提取溶剂。2.2.2净化方
19、法的选择QuEChERS是目前残留检测中常见的净化方法。本研究以鸡粪、猪粪、牛粪等3种基质为例,考虑到这几种粪便中可能存在水分、脂肪、蛋白质、色素以及一些特殊的杂质。因此,选择具有吸附油脂NO.172023饲料研究FEEDRESEARCH115检测技术和蛋白质作用的C18固相萃取柱,吸附色素的Carb固相萃取柱以及吸附一些极性强杂质的氨基固相萃取柱作为对比,筛选净化畜禽粪便的方法。表119种喹诺酮的质谱参数驻留时间/Q1 PreQ3 Pre项目母离子子离子CE/VmsBias/VBias/V362.2318.2*30-30-18-24氧氟沙星362.2261.130-30-28-19320.2
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