Golgi-Cox法标记小鼠脑神经方法的比较_文柏清.pdf
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1、 第 卷 第 期 年 月:法标记小鼠脑神经方法的比较文柏清,张 倪,康亚妮(上海交通大学 生物医学工程学院,上海)摘 要:为研究脑神经的结构特征,基于 染色原理,比较了 种小鼠脑组织样品制备方法,探索了一种简单有效的神经标记方法。将小鼠断颈或麻醉后,采用 种不同的灌注方法,将取出的脑组织固定、浸染、振动切片、脱水及封片后进行光学显微镜成像,观察脑切片制备效果。比较这 种样品制备方法的光学显微镜成像结果,表明通过应用多聚甲醛固定的 法制备的切片背景浅淡,非特异性沉淀颗粒少,且切片不易破碎,更加稳定。脑神经标记流程的探究为教学和科研提供了可选方案。关键词:脑组织;神经元;染色法;小鼠;灌注;神经标
2、记中图分类号:文献标志码:文章编号:(),(,):,:;收稿日期:基金项目:上海市自然科学基金项目();转化医学国家重大科技基础设施(上海)项目();上海交通大学医工交叉研究基金项目(,)作者简介:文柏清(),女,重庆万州人,硕士生,研究方向为脑神经标记方法研究。:;:通信作者:康亚妮(),女,上海人,博士,高级工程师,主要从事神经医学工程、生物与医药研究。:;:引 言卡米洛高尔基()于 年发现,利用铬酸银溶液浸泡大脑切片,可以使小部分神经元全部染色,即高尔基染色()。高尔基方法的主要优点之一是神经染色具有随机性的,因为它只染色任何一个选定区域大约 的神经元。这种随机染色使得单个神经元几乎所有
3、结构可视化,包括体细胞、轴突、树突和树突棘。随后,多种研究对该方法进行了改良,如由 提出的快速高尔基染色法()、高尔基柯普奇法()和高尔基考克斯()。第 卷 法以氯化汞取代硝酸银进行神经标记,并通过铬酸钾缓和溶液的过度酸性反应。该方法优于快速高尔基染色法,标记的神经元更多,且重复实验结果更加稳定,被广泛用于观察神经元和神经胶质细胞的形态,但其性质不确定、一致性差、染色时间长等因素阻碍了其作为首选方法应用。是基于 方法研发的,其以试剂盒的形式为分析神经元形态提供了一种简单、可靠、可重复性好的神经浸渍方法,且目前已广泛用于神经研究。目前基于 染色原理,已有多种改良创新方法被提出,其中,的开发,使神
4、经形态的观察研究更加简便。李方等通过多聚甲醛固定组织、缩短浸胶时间、组织块外包石蜡壳等实验调整,发现改良 神经元染色法在大鼠脑缺血研究中,染色结果较恒定,且省时。冯宝峰等对固定、切片、脱水和显色等环节进行改良后,证明相较于传统的 染色方法,该方法更加稳定和敏感,为海马区神经元树突和树突棘形态与结构研究提供了一种可靠的技术方法。王蕾等比较了冷冻切片、石蜡切片和振动切片 种切片方式对结果的影响,并阐述了各自的优缺点。本研究采用 种不同的灌注方法后使用相同的固定、染色和显色液,结合流程化的商用实验步骤,进行振动切片脱水后,再使用明胶包埋的载玻片封片,最后使用光学显微镜成像比较不同灌注方法的脑切片制备
5、效果。探索一种简单有效的神经标记方法,为实验科研、教学及神经研究提供可选方案。实验材料与方法.实验材料()动物。周龄 小鼠 只,分别编号为、。()试剂。实验所使用的试剂如表 所示。表 实验所需试剂材料公司货号多聚甲醛 (含 瓶、液体)无水乙醇生工生物工程(上海)股份有限公司 二甲苯国药集团化学试剂有限公司琼脂糖铬矾明胶包被液捷世康生物有限公司.实验方法()准备。实验前 将 液按 混合,在混合时尽量避免摇晃与碰撞,且避光保存,使用锡纸包覆试管外壁。()灌注。小鼠断颈后,不做灌注处理;、小鼠均先使用.水合氯醛麻醉,然后使用生理盐水灌流去血;小鼠使用 多聚甲醛(,)灌注固定;小鼠用 混合液灌注。()
6、取材。打开小鼠的头骨,小心取出脑组织。()固定。使用提前配制的 混合液浸泡 后,置换试管中的 混合液,继续浸泡 。然后将脑组织转移至 液中室温避光 ,首次浸泡 后更换 液 次。具体参见 。()切片和贴片。将脑组织用 的琼脂糖包埋后进行振动切片,切片厚 和 。载玻片提前用钾矾明胶包被液进行涂布,干燥后,将切好的脑片贴于明胶玻片上,用吸水纸吸干多余的 液。()染色。将 液、液与双蒸馏水以 的体积比混合,现配现用,然后于混合溶液中 ;再用双蒸馏水冲洗切片 次,每次 。()脱水脱脂。使用、和 的乙醇梯度脱水,各 ,再使用无水乙醇脱水 次,每次;二甲苯浸泡 次,每次 。()封片。使用中性树脂封片。()成
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