MCC950下调NLRP3炎症小体对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气管重塑及嗜酸性粒细胞水平的影响.pdf
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1、中国现代医学杂志Vol.33 No.17Sept.2023第 33 卷 第 17 期2023 年 9 月China Journal of Modern MedicineMCC950下调NLRP3炎症小体对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气管重塑及嗜酸性粒细胞水平的影响*陈培1,陈小菊1,杜竺蔓1,汪操会2(1.成都大学附属医院 呼吸与危重症医学科,四川 成都 610081;2.成都市金牛区营门口社区卫生服务中心 全科医学科,四川 成都 610031)摘要:目的探究MCC950下调NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠气管重塑及嗜酸性粒细胞水平的影响。
2、方法将60只小鼠随机分为对照组、COPD组和MCC950组。采用脂多糖联合香烟烟雾的方法复制COPD大鼠模型。HE染色分析各组大鼠肺组织病理变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组大鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-6(IL-6)水平;Western blotting检测各组大鼠NLRP3相关蛋白表达;检测大鼠嗜酸性粒细胞及趋化因子水平。结果与对照组比较,COPD组大鼠肺组织中NLRP3、Cleaved caspase-1和
3、ASC蛋白相对表达量升高(P 0.05);肺组织表现出严重病理损伤和炎症细胞大量聚集(P 0.05);血清MMP-2、MMP-9、TNF-和IL-6水平升高(P 0.05),TIMP-1和TIMP-2水平降低(P 0.05);细支气管壁厚度、管壁面积和管壁面积/腔周长均增加(P 0.05);静脉血嗜酸性粒细胞水平增加(P 0.05)。预先注射MCC950后,以上指标均得到逆转(P 0.05)。结论MCC950下调NLRP3炎症小体后,能够影响COPD大鼠气管重塑,改善COPD大鼠的肺组织损伤,以及降低静脉血嗜酸性粒细胞的水平。关键词:慢性阻塞性肺疾病;MCC950;NOD样受体热蛋白结构域相关
4、蛋白3;嗜酸性粒细胞中图分类号:R562.21文献标识码:AEffects of MCC950 down-regulating NLRP3 inflammatory vesicles on airway remodeling and EOS levels in rats with COPD*Chen Pei1,Chen Xiao-ju1,Du Zhu-man1,Wang Cao-hui2(1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Affiliated Hospital of Chengdu University,Chengdu
5、,Sichuan 610081,China;2.Department of General Medicine,Yingmenkou Community Health Service Center,Jinniu District,Chengdu,Sichuan 610031,China)Abstract:Objective To investigate the effect of NOD-like receptor family pyrin domain containing 3(NLRP3)inflammatory vesicles down-regulated by MCC950 on ai
6、rway remodeling and eosinophils(EOS)level in rats with chronic obstructive pulmonary disease(COPD).Methods Sixty mice were randomly divided into three groups:control group,COPD group and MCC950 treatment group.A rat model of COPD was established by lipopolysaccharide combined with smoke.HE staining,
7、ELISA,western blot and flow cytometry were used to analyze the structural changes of lung tissue,bronchiolar wall thickness,wall area,wall area/lumen perimeter,NLRP3-related protein expression,airway remodeling-related factor levels and venous eosinophil content in each 慢性阻塞性肺疾病专题 论著DOI:10.3969/j.is
8、sn.1005-8982.2023.17.001文章编号:1005-8982(2023)17-0001-06收稿日期:2023-02-15*基金项目:四川省卫生健康委员会医学科技项目(No:21PJ126);成都大学本科教育教学改革项目(No:cdjgb2019088)通信作者 陈小菊,E-mail:;Tel:13989185102 1中国现代医学杂志第 33 卷 group.Results Compared with control group,the levels of NLRP3,Cleaved caspase-1 and ASC were increased in COPD group
9、(P 0.05).The lung tissue showed serious pathological injury and large accumulation of inflammatory cells(P 0.05).The contents of MMP-2,MMP-9,TNF-and IL-6 in serum were increased(P 0.05),while the contents of TIMP-1 and TIMP-2 were decreased(P 0.05).Bronchial wall thickness,tube wall area and tube wa
10、ll area/cavity circumference were increased(P 0.05).The content of eosinophil in venous blood was increased(P 0.05).After pre-injection of MCC950,the above indexes were reversed(P 0.05).Conclusion Down-regulation of NLRP3 inflammatory vesicles by MCC950 can affect airway remodeling,ameliorate lung t
11、issue injury and decrease the content of EOS in venous blood of COPD rats.Keywords:pulmonary disease,chronic obstructive;MCC950;NOD-like receptor family pyrin domain containing 3;eosinophils慢 性 阻 塞 性 肺 疾 病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以持续存在的气流受限为特征的常见、多发呼吸道疾病,因其气流受限不完全可逆,病情常呈现逐年缓慢进展
12、合并急性加重的临床特点1。急性加重性炎症的反复发作及氧化应激导致的呼吸道组织细胞损伤是 COPD患者死亡的主要原因2。目前临床仍缺乏有效治疗COPD的手段3,因此探索新的COPD治疗策略具有重要意义。长期暴露于香烟环境是诱发COPD的关键危险因素之一4。以往研究表明,连续暴露于香烟环境 6 个月以上可复制稳定的 COPD 动物模型5。近年来,应用香烟烟雾联合脂多糖导致COPD炎症和黏液分泌过多的COPD动物模型得到了广泛应用。研究指出香烟烟雾联合脂多糖可以诱导促炎症细胞因子的释放,如肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)和干扰素-(Interferon-,IN
13、F-)等炎症因子,从而更有效地模拟COPD病程发展及特征性呼吸道病理学改变6-7。NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)的炎症体研究最广泛,其能感知一系列致病、环境和宿主衍生的因素8。既往研究指出NLRP3参与COPD的发生、发展9-12。NLRP3激活后结合并激活凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain,ASC),促进半胱氨酸蛋白酶-1(cy
14、steinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)形成炎症体复合物,启动Caspase-1 的自催化裂解并促进白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)和 白 细 胞 介 素-18(Interleukin-18,IL-18)的分泌,最终引起呼吸道组织细胞破坏,引发 COPD13-14。因此,针对 NLRP3这一潜在治疗靶点改善或逆转COPD的发生、发展具有很高的研究价值。本研究通过复制COPD大鼠模型,探讨 NLRP3 抑制剂 MCC950 对 COPD 的潜在治疗效果。1 材料与方法1.1主要材料和仪器NLRP3 抑制剂 MCC9
15、50(上海陶术生物科技有限公司),脂多糖(北京金克隆生物技术),NLRP3抗体(深圳欣博盛生物科技),裂解的半胱氨酸蛋白酶-1(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Cleaved caspase-1)抗体(武汉菲恩生物科技有限公司),ASC 抗体、-肌动蛋白(-actin)抗体(美国Santa Cruz 公 司),Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(普健生物武汉科技有限公司),Mouse ELISA 试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司),苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒(上
16、海歌凡生物科技有限公司),RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液(上海康朗生物科技有限公司),磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)(上海碧云天生物技术有限公司),戊 巴 比 妥 钠(北 京 索 莱宝科技有限公司)。石蜡切片机、低温高速离心机(美国 Thermo Fisher Scientific 公司),荧光显微镜(上海光密仪器有限公司),凝胶成像系统(上海嘉鹏科技有限公司),酶标仪(美国 BioTek 公司),蛋白免疫印迹实验全套设备(德国Protec公司)。1.2动物模型复制和分组雄性SD大鼠(68周龄)60只
17、购自南京集萃药康公司(实验动物生产许可证号:SCXK 苏 2021-0013;实 验 动 物 使 用 许 可 证 号:SYXK 苏 2021-00162023-06-05),饲养在(231)、12/12 h 昼夜交替环境中,正常给予饲料和纯净水。小鼠随机分为对照组、COPD组和MCC950组,每组20只。2第 17 期陈培,等:MCC950下调NLRP3炎症小体对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气管重塑及嗜酸性粒细胞水平的影响COPD组和MCC950组大鼠参考文献10的方法使用脂多糖和香烟烟雾联合诱导30 d复制COPD大鼠模型,对 照 组 不 做 任 何 处 理。模 型 复 制 前 24 h MCC
18、950组大鼠腹腔注射60 mg/kg MCC950,对照组与 COPD 组大鼠注射等量 PBS。第 31 天 使 用 戊 巴比妥钠(200 mg/kg)安乐死所有大鼠,并收集实验标本。本实验得到医院动物伦理委员会批准。1.3HE染色分析大鼠肺组织病理变化通过戊巴比妥钠安乐死大鼠后,立即使用PBS灌注肺部,4 条件下 4%多聚甲醛中固定过夜,次日酒精梯度脱水,石蜡包埋肺组织,切片(厚度5 m)。苏木精和伊红依次染色。炎症程度评估标准采用04分的5点法进行评估:0分,无炎症表现;1分,轻度炎症;2分,中度炎症;3分,重度炎症;4分,非常重度炎症。使用Image J图像分析软件测量各组大鼠细支气管壁
19、厚度,并计算管壁面积和管壁面积/腔周长。1.4酶联免疫吸附试验测定大鼠气管重塑相关因子水平大鼠安乐死后,用软管通过气管插管后,用5 L预冷PBS进行灌洗,重复3次,收集其支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。采用酶联免疫吸附试验测定 BALF 中的基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、基质金属蛋 白 酶 组 织 抑 制 剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,
20、TIMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑 制 剂-2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2,TIMP-2)、TNF-、白 细 胞 介 素-6(Interleukin 6,IL-6)水平,操作过程严格按照试剂盒说明书进行。1.5 Western blotting 检 测 NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白表达大鼠肺组织经 PBS 清洗后,用 RIPA 缓冲液匀浆,并在100 下煮沸10 min。总蛋白在4%12%的 SDS-PAGE 上分离并转移到 PVDF 膜上。室温下用 TBST(50 nmol Tris-HCl,150 mmo
21、l NaCl,0.05%Tween 20,pH 7.5)中的 5%脱脂牛奶阻断 1 h 后,4 条 件 下 用 一 级 特 异 性 抗 体(NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC 和 GAPDH)孵育过夜,随后在室温下用二级 HRP 结合的抗体孵育 4 h。使用增强型化学发光检测试剂盒对蛋白显影。GAPDH 为内参蛋白,使用Quantity One软件分析各组蛋白灰度值。1.6大鼠嗜酸性粒细胞及趋化因子水平检测模型复制第30天时,使用戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠,抽取各组大鼠静脉血 2 mL,采用美国贝克曼库尔特公司dXh 800型全自动血液分析仪测定嗜酸性粒细胞水平
22、;采用酶联免疫吸附试验测定血清嗜酸性粒细胞趋化因子水平。1.7统计学方法数据分析采用 SPSS 25.0 统计软件。计量资料用均数标准差(xs)表示,比较用方差分析,两两比较用LSD-t 检验;P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1各组大鼠肺组织病理结构变化HE 染色结果显示,对照组大鼠的肺组织形态正常,而 COPD 组表现出严重的病理损伤和炎症细胞大量聚集。与COPD组比较,MCC950组大鼠的肺组织损伤得到改善,炎症细胞数量减少。见图1。对照组、COPD 组和 MCC950 组炎症程度评分分别为(0.520.01)、(3.760.05)、(1.340.02)分,3 组比较,经方差分
23、析,差异有统计学意义(F=14.673,P=0.000);与对照组比较,COPD组炎症程度评分增加(P 0.05);与 COPD 组比较,MCC950 组炎症程度评分降低(P 0.05)。2.2各组大鼠细支气管壁厚度、管壁面积、管壁面积/腔周长比较对照组、COPD组和MCC950组大鼠细支气管壁厚度、管壁面积和管壁面积/腔周长比较,经方差分析,差异均有统计学意义(P 0.05)。与对照组比较,COPD组大鼠细支气管壁厚度、管壁面积和管壁面积/腔周长均升高(P 0.05);与 COPD 组比较,MCC950 组大鼠细支气管壁厚度、管壁面积和管壁面积/腔周长均降低(P 0.05)。见表1。2.3各
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