HPLC双波长法同时测定黄连上清片中栀子苷和盐酸小檗碱的含量.pdf
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1、收稿日期:2 0 2 2-1 1-1 3基金项目:内蒙古医科大学重大基金项目(项目编号:Y K D 2 0 2 1 M S 0 2 2)作者简介:钮松召(1 9 7 7-),男,内蒙古呼和浩特人,硕士,主要研究方向:药物分离分析。H P L C双波长法同时测定黄连上清片中栀子苷和盐酸小檗碱的含量钮松召,白文明,苏日娜,卢 菲,张晓杰,韩庆哲(内蒙古医科大学 药学院,呼和浩特 0 1 0 1 1 0)摘要:研究开发同时测定黄连上清片中栀子苷和盐酸小檗碱两种有效成分的定量方法。采用Z O R B A XE c l i p s eX D B-C 1 8(4.62 5 0 mm,5m)色谱柱,流动相:
2、A泵为乙腈,B泵为0.2%磷酸,切换波长检测:01 0分钟检测栀子苷(=2 3 8 n m)、1 05 0分钟检测盐酸小檗碱(=3 4 5 n m),流速为1.0 m l/m i n,梯度洗脱,柱温为3 0,进样1 0L。可使各组分有效分离,栀子苷的回归方程:y=4 3 6 5 1 x-1 0 2 7(r=0.9 9 9 6)、加样回收率的平均值为9 8.9 5%(R S D=1.5%);盐酸小檗碱的回归方程:y=2 7 5 1 9 x-2 8 3 6(r=0.9 9 9 5)、加样回收率的平均值为9 9.0 7%(R S D=1.7%)。结果说明此法快速、专属性高,可用于对黄连上清片的质量控
3、制。关键词:黄连上清片;H P L C;双波长法;栀子苷;盐酸小檗碱中图分类号:R 2 8 4 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 6-7 9 8 1(2 0 2 3)0 7-0 0 1 8-0 4 黄连上清片由十七味中药组成,其中包括黄连、栀子、连翘、菊花、大黄、黄芪等,具有清热解毒、降火、镇痛等功效,可用于上火或胃热造成的头晕、眼睛红肿、咽喉肿痛等症1。栀子柑为主药之一,具有清热利湿,凉血解毒等功效。黄连作为主药之一,具有清热燥湿,泻火通便等功效2,其主要成分为盐酸小檗碱、黄连碱等。对于黄连上清片的质量控制3-6,是通过测定黄芪、大黄、栀子等多种指标成分的含量评价进行控制的。本研究经多次
4、试验优化,最终建立了H P L C通过梯度洗脱,切换波长法,同时测定了黄连上清片中栀子苷和盐酸小檗碱两种有效成分,为该制剂的质量控制提供了参考。1 材料1.1 仪器F L 2 2 0 0-2高相液相色谱仪,F L 2 2 0 0-2紫外检测器,KQ-8 0 0 K D E型超声清洗仪,D T-5 0 0 B电子天平,HH-S 4数显恒温水浴锅1.2 药品与试剂栀子苷对照品购于中国药品生物制品检定所;黄连上清片(云南白药集团股份有限公司);盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所);乙腈溶液为F i s h e r色谱纯试剂,磷酸、甲醇为分析纯,水为娃哈哈牌纯净水。2 方法与结果2.1 溶液的配
5、制2.1.1 对照品溶液配制:精密称取栀子苷0.4 8 m g、盐酸小檗碱0.7 3 m g分别至1 0 m L量瓶,用分析甲醇定容,摇匀后静置,超声提取1 5 m i n,冷却,补足容量瓶中 缺 失 的 分 析 甲 醇,摇 匀 即 得 浓 度 分 别 为0.0 4 8 m g/m L、0.0 7 3 m g/m L的栀子苷、盐酸小檗碱对照品溶液。2.1.2 供试品溶液配制:取黄连上清片,研磨过筛,称0.5 g,于2 5 m L盐酸-甲醇(1:1 0 0)混合溶液中溶解,第一次称重,于5 0热水中进行1 5 m i n加热处理,冷至室温,超声提取0.5 h,冷至室温,第二次称重,两次称重差异用
6、甲醇补至足量,抽滤,续滤液经0.2 2m微孔滤膜过滤,即得。2.2 色谱条件与系统适用性试验Z O R B A XE c l i p s eX D B-C 1 8(4.62 5 0 mm,5m)色谱柱;流动相:A泵为乙腈,B泵为0.2%磷酸,切换波长检测:01 0分钟检测栀子苷(=2 3 8 n m)、1 05 0分钟检测盐酸小檗碱(=3 4 5 n m),梯度洗脱(见表1),流速:1.0 m l/m i n。色谱图见图1。2.3 线性关系考察81 内蒙古石油化工2 0 2 3年第7期 取混合对照品储备溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L分别置于1 0m L容量瓶中,甲醇溶液定容,
7、配制成不同浓度的对照品溶液,分别精密吸取不同浓度的溶液1 0l,按上述色谱条件进样,记录两种有效成分的峰面积。分别以峰面积为y轴,进样量为x轴回归方程(见表2)。表1 梯度洗脱程序时间,m i n流动相A,%流动相B,%01 58 51 02 37 74 09 01 05 09 01 0AB图1 高效液相色谱图A.供试品(1.栀子苷;2.盐酸小檗碱);B.混合对照品表2 线性回归方程(n=6)成分回归方程线性范围/g栀子苷y=4 3 6 5 1 x-1 0 2 7(r=0.9 9 9 6)0.0 4 8 00.9 6 0 0g盐酸小檗碱y=2 7 5 1 9 x-2 8 3 6(r=0.9 9
8、 9 5)0.0 7 3 01.4 6 0g2.4 精密度试验按“2.2”中的条件,取上述栀子柑和盐酸小檗碱对照品7.5L,重复注入高效液相色谱仪(6次),记录两种有效成分的峰面积,结果见表3,表明用于黄91 2 0 2 3年第7期钮松召等 HP L C双波长法同时测定黄连上清片中栀子苷和盐酸小檗碱的含量连上清片的检测仪器精密度良好。表3 精密度试验结果(n=6)成分栀子柑盐酸小檗碱峰面积的R S D,%1.3%1.2%2.5 稳定性试验取“2.1.2”中制备的黄连上清片供试品,按“2.2”中建立的条件,分别在0、2、4、6、8、1 2、2 4 h时注入高效液相色谱仪,测定结果见表4,结果表明
9、在2 4 h内,其稳定性好。表4 稳定性试验结果(n=7)成分栀子柑盐酸小檗碱峰面积的R S D,%1.4%1.6%2.6 重复性试验取同一批黄连上清片,按“2.1.2”中方法,配制供试品(6份),按“2.2”中条件注入H P L C仪定量(见表5),可说明此法重复性较好。表5 重复性试验结果(n=6)成分平均含量,m g/gR S D,%栀子苷0.4 8 7 51.5盐酸小檗碱0.5 2 0 81.32.7 加样回收率试验称取样品(含量已知)6份,各0.5 g,各自加入低、高量的两种待测组分的对照品,按“2.1.2”法制黄连上清片供试品,再按“2.2”中建立的条件,注入H P L C仪,结果
10、见表6。表6 加样回收率试验结果(n=6)成分平均加样回收率,%R S D,%栀子苷9 8.9 51.8盐酸小檗碱9 9.0 71.72.8 样品含量测定取3批样品,每批3份,按“2.1.2”中方法制供试品,并按“2.2”中条件注入H P L C仪,得到两种待测组分的峰面积,代入线性回归方程,计算得到栀子苷和盐酸小檗碱的含量,结果见表7。表7 样品含量测定结果(n=3)序号栀子苷,m g/gR S D,%盐酸小檗碱,m g/gR S D,%10.4 8 6 11.10.5 2 1 21.320.4 8 5 21.20.5 2 1 81.230.4 8 8 61.50.5 2 0 31.53 讨
11、论3.1 测定波长的选择首先选择了可同时兼顾到栀子柑和盐酸小檗碱的单一波长2 5 4 n m进行检测9。栀子苷的最大吸收波长为在2 3 8 n m,盐酸小檗碱在最大吸收波长为2 3 0、2 6 5、3 4 5 n m8。考虑到栀子柑在样品中的含量相对较低,同时可兼顾到盐酸小檗碱的最大吸收波长,因此首先选用了2 5 4 n m单一波长进行检测,但经多次试验发现,盐酸小檗碱在该波长下分离效果不好。为使栀子苷和盐酸小檗碱的测定都有较高的灵敏度,查阅相关文献1 0-1 5可知,盐 酸小檗碱在2 3 0、2 6 5n m处吸光度较小,在3 4 5n m吸光度较大且受其他组分干扰较小1 6。故选择栀子苷2
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