GCRV感染存活草鱼的血清蛋白表达特性.pdf
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1、doi:10.7541/2023.2023.0043GCRV感染存活草鱼的血清蛋白表达特性阳 鸿 邓亚东 丁春华 许宝红 吕 钊*肖调义*(湖南农业大学水产学院,长沙 410128)摘要:为挖掘草鱼关键抗性分子,研究利用4D label-free定量蛋白质组学技术系统分析了团队前期获得的GCRV感染存活草鱼(候选抗性草鱼)与对照草鱼的血清蛋白表达差异。共鉴定到858个草鱼血清蛋白,329个蛋白在两类草鱼中差异表达,其中163个蛋白在候选抗性草鱼血清中显著高表达,166个蛋白显著低表达。差异表达蛋白的功能主要注释为体液免疫反应调节相关蛋白,显著富集到补体凝血级联、细胞黏附和铁死亡等信号通路。对差
2、异表达的免疫相关蛋白进行分析发现,候选抗性草鱼血清中体液免疫分子MASP2、C4a、C4b、C7b、C8b、C8g、C9、CFI、C3a.1、C3a.2、C3a.3和C3a.6等补体和抗原提呈相关免疫分子MHC1UBA和IGL4V8等蛋白表达水平显著高于对照草鱼,而T细胞免疫相关分子TRAV、IGHV1-1、IGHV2-1、IGHV6-1、IGHV3-2和IGHV11-2等蛋白表达水平显著低于对照草鱼。免疫印迹检测进一步证实,以C3和IgM为代表的体液免疫分子在候选抗性草鱼血清中显著高表达,可能与草鱼抗病能力关联。研究将为高抗性草鱼的选育提供可参考的分子资源。关键词:蛋白质组;血清;抗性分子;
3、体液免疫;草鱼中图分类号:S941.41 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2024)02-0304-11 草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国“四大家鱼”之一,年产量居淡水养殖品种之首。然而,草鱼常因感染草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)而患草鱼出血病,死亡率可达90%1,给我国草鱼养殖业造成巨大经济损失。尽管近年来在草鱼出血病致病机理解析、疫苗研制、中草药开发等方面取得了重要进展2,3,但目前仍没有稳定防控草鱼出血病的策略。研究发现不同地域草鱼群体的免疫机能存在差异4,不同个体应对GCRV的抗性存在差异5,基于自然界存在的
4、GCRV抗性草鱼群体开展分子辅助选育获得高抗性草鱼品系是解决草鱼出血病难题的有效途径之一。鱼类抗病性状由多基因决定,因此挖掘关键抗性基因及遗传标记对高抗性品系分子辅助选育具有重要意义6。关于草鱼GCRV抗性基因及分子标记的研究已有报道,以往研究结果揭露草鱼补体、模式识别受体、干扰素及干扰刺激因子等免疫基因5,710在抗GCRV感染中发挥重要作用,其中Toll样受体8基因、黑色素瘤分化相关基因5、视黄酸诱导基因、抗黏液病毒基因等存在与GCRV抗性关联的遗传标记1114。但由于这些研究比较分散,仅局限在单个基因,目前仍难以确认草鱼关键的GCRV抗性基因。随着测序技术的进步及草鱼全基因组序列的破译1
5、5,利用组学系统地挖掘草鱼抗性基因成为重要的研究方向。Xu等16通过比较GCRV感染前后的草鱼脾脏转录组发现,差异表达基因主要注释为补体凝血级联及细胞因子与细胞因子互作等先天性免疫通路相关的基因。Li等17通过比较分析易感染GCRV的一龄草鱼和不易感染GCRV的三龄草鱼脾脏转录组,筛选到差异表达基因9450个,主要富集在补体凝血级联、TLR信号转导等免疫相关的通路。此外,本团队前期对GCRV感染前后草鱼头肾进行了miRNA测序分析,共筛选到118个差异miRNAs,这些 miRNAs的靶基因达数第 48 卷 第 2 期水 生 生 物 学 报Vol.48,No.2 2024 年 2 月ACTA
6、HYDROBIOLOGICA SINICAF e b.,2 0 2 4 收稿日期:2023-02-08;修订日期:2023-04-19基金项目:国家自然科学基金(U20A2063);湖南省自然科学基金(2021JJ40244)资助 Supported by the National Natural Science Foun-dation of China(U20A2063);Natural Science Foundation of Hunan Province(2021JJ40244)作者简介:阳鸿(1997),博士;主要研究方向为水生生物学。E-mail:通信作者:吕钊,E-mail:lv
7、zhao_ 肖调义,E-mail:*为共同通信作者The Author(s)2024.This is an open access article under the CC-BY 4.0 License(https:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/).千个,主要富集在肌动蛋白细胞骨架的调节以及趋化因子与趋化因子受体等信号通路18。转录组测序分析系统评价了草鱼GCRV抗性的分子基础,而缺点是筛选到的抗性基因过多,判别关键抗性基因具有难度。蛋白质是生命活动的主要执行者,蛋白质组比转录组可以更直接、真实地反映生物表型变化。目前蛋白质组学技术已经在人类和动植物
8、疾病标志物筛选及农业生物抗病品系培育等研究中得到广泛应用,利用疾病抗性/易感群体开展蛋白质组分析筛选到了人类抑郁症19、家蚕核型多角体病20和小麦赤霉病21等疾病的抗性/易感关键基因,而对鱼类相关研究的报道还较少。动物血清是疾病检测中最常用的样本,血清蛋白参与机体免疫、凝血/抗凝血、物质运输等多种重要的生理过程,血清蛋白在结构和数量上的改变可反映机体的生理或病理状况22,23。通过血清蛋白质组学研究分析疾病抗性/易感动物群体的血清蛋白表达差异有利于挖掘关键的抗性基因20,21。团队前期利用大规模群体感染的方式获得了候选GCRV抗性草鱼材料,本研究将应用4D label-free定量蛋白质组学分
9、析技术,系统比较候选抗性草鱼材料与对照草鱼血清蛋白表达的差异,解析抗性相关的关键分子组成,旨在丰富草鱼GCRV抗性分子基础的理论研究,为高抗性草鱼选育及分子设计育种工作提供可参考的信息。1 1 材料与方法 1.11.1 实验材料实验用草鱼来自湖南农业大学耘园鱼类繁育基地,候选抗性草鱼材料为团队前期利用GCRV感染筛选的存活群体,将未经感染的健康草鱼作为对照组。随机选取规格为1417 cm的候选抗性组草鱼与对照组草鱼各30尾,每组设置3个重复,每个重复10尾草鱼。采样前在循环水养殖系统28暂养7d,随后进行尾静脉采血,4静置过夜后吸取上清,分别混合抗性组与对照组草鱼各重复10尾草鱼的血清并保存于
10、80冰箱备用。1.21.2 蛋白样品检测及酶解利用BCA试剂盒(Thermo Fisher,美国)对草鱼血清进行蛋白浓度测定,同时使用SDS-PAGE凝胶电泳检测血清样品中蛋白的完整性。随后取各样品等量蛋白进行还原,即加入终浓度为5 mmol/L的二硫苏糖醇,置于56孵育30min。之后加入终浓度为11 mmol/L的碘乙酰胺,室温避光孵育15min进行烷基化。将烷基化好的样品转移至超滤管,室温12000g离心20min,接着用8 mol/L尿素溶液置换3次,用置换溶液置换尿素3次,然后以150的比例(蛋白质与蛋白酶比例)加入胰蛋白酶,酶解过夜。室温12000g离心10min回收酶解肽段,接着
11、用超纯水清洗回收肽段1次,合并两次收集的肽段溶液,待质谱分析。1.31.3 液相色谱-质谱联用分析肽段溶液用液相色谱流动相A相溶解后,采用EASY-nLC1200超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液;流动相B为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度设置为:096min,4%20%B;96112min,20%32%B;112116min,32%80%B;116120min,80%B,流速维持在500 nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离,然后在Orbit-rap Exploris480仪器进行质谱分析。离子源电压设置为2.3
12、kV,FAIMS补偿电压设置为70和45 V之间交替,肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为4001200 m/z,扫描分辨率设置为60000;二级质谱扫描范围固定起点为110 m/z,二级扫描分辨率设置为30000,Turbo TMT设置为Off。数据采集模式使用数据依赖型扫描程序,即在一级扫描后选择信号强度最高的前15肽段母离子依次进入HCD碰撞池,使用27%的碎裂能量进行碎裂,同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率,自动增益控制设置为75%,信号阈值设置为1E4 ions/s,最大注入时间设置为100ms,串联质谱扫描的动态
13、排除时间设置为30s以避免母离子的重复扫描。1.41.4 质谱数据比对鉴定及定量使用软件Proteome Discoverer(v2.4.1.15)对质谱数据在已有数据库进行比对和检索。检索参数设置:数据库设置为斑马鱼蛋白质组数据,于Uni-prot蛋白数据库下载获得,添加反库计算随机匹配造成的假阳性率(FDR);酶切方式设置为Trypsin(Full);漏切位点数设为2;肽段最小长度设置为6个氨基酸残基;肽段最大修饰数设为3;一级母离子质量误差容忍度设为10 ppm,二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02 Da。将Carbamidomethyl(C)设置为固定修饰,将Oxidation(M)
14、、Acetyl(N-termi-nus)、Met-loss(M)、Met-loss+acetyl(M)和Deami-dated(N,Q)设置为可变修饰。将蛋白、肽段和PSM鉴定的FDR都设置为1%。依据Proteome Dis-coverer软件计算的LFQ intensity值,经标准化得出蛋白在不同样本中的相对定量值。2 期阳 鸿等:GCRV感染存活草鱼的血清蛋白表达特性305 1.51.5 数据质控分析质谱下机的数据,在完成数据库比对后,对其进行一系列质控评价,包括肽段长度分布、肽段数分布、蛋白覆盖度分布和蛋白分子量分布。在进行蛋白定量之后,采用皮尔森相关性(Pearsons Cor-r
15、elation Coefficient,PCC)统计分析方法评估样品间的重复性。1.61.6 差异表达蛋白筛选及功能注释与富集依据蛋白质丰度水平,当两组样品蛋白平均表达量差异倍数Fold change1.2或0.83且经t检验P50%40%50%30%40%20%30%10%20%010%481150626E数量Number每个蛋白对应的肽段数Peptides per protein60080040020001 2 3 4 5 6 7 8 9 1012131415161718192020110101020203030404050506060707080809090100100110110120
16、1201301301401401501501601601701701801801901902002002345图 2 候选抗性草鱼与对照草鱼血清蛋白样品的质谱数据分析Fig.2 Mass spectrometry analysis of serum protein samples from the candidate resistant grass carps and the control grass carpsA.血清蛋白质谱鉴定;B.皮尔森相关性分析,Ci_sus_13代表对照草鱼样品,Ci_res_13代表候选抗性草鱼样品;C.肽段长度分布;D.蛋白分子量分布;E.每个蛋白对应的肽段数
17、;F.蛋白覆盖度A.mass spectrometry identification and analysis of serum proteins.B.Pearson correlation analysis.Ci_sus_13 represent the samples fromthe control grass carps;Ci_res_13 represent the samples from the candidate resistant grass carps.C.peptide length distribution analysis.D.protein molecular wei
18、ght distribution analysis.E.peptide numbers of every protein.F.protein coverage analysis2 期阳 鸿等:GCRV感染存活草鱼的血清蛋白表达特性307下机数据的综合质控评价结果良好,可用于下一步分析。2.32.3 候选抗性草鱼与对照草鱼的血清蛋白质组比较分析差异表达蛋白筛选本研究以火山图形式显示了候选抗性草鱼与对照草鱼血清蛋白差异表达情况,候选抗性草鱼与对照草鱼血清中共筛选到329个差异表达蛋白(差异倍数大于1.2倍);其中163个蛋白在候选抗性草鱼血清中显著高表达,166个蛋白显著低表达(图 3)。差异表达
19、蛋白的功能分类为分析329个差异表达蛋白的生物学功能,对差异表达蛋白进行了COG功能分类以及亚细胞结构定位预测。COG功能分类结果显示,差异表达蛋白中有169个蛋白的功能可归类为细胞过程和信号转导,32个蛋白的功能归类为信息储存与处理,66个蛋白的功能归类为代谢,17个蛋白的功能未知。这些蛋白的功能具体主要涉及翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣、信号转导机制、细胞骨架等(图 4A)。亚细胞定位预测分析发现,此次实验鉴定到的差异表达蛋白大部分为细胞质蛋白及细胞外蛋白,占比66.57%;其中细胞质蛋白有118个,细胞外蛋白有99个(图 4B)。差异表达蛋白的功能富集为进一步明晰差异表达蛋白的生物学功
20、能,利用Fisher氏精确双端检测方法对差异蛋白进行GO、KEGG及Do-main富集分析。图 5A列出了P0.05的所有GO条目,差异表达蛋白主要富集到生物过程(BP)中的体液免疫反应调节(Regulation of humoral immune re-sponse)和补体激活调节(Regulation of complementactivation)等条目,细胞组分(CC)中的细胞外空间(Extracellular space)和细胞外区域(Extracellular re-gion)等条目及分子功能(MF)中的丝氨酸蛋白酶活性(Serine hydrolase activity)和丝氨酸
21、型肽酶活性(Serine-type peptidase activity)等条目。KEGG富集分析显示,差异表达蛋白主要富集在补体凝血级联(Complement and coagulation cas-cades)、细胞黏附分子(Cell adhesion molecules)、胆固醇代谢(Cholesterol metabolism)和铁死亡(Fer-roptosis)等免疫与代谢相关信号通路(图 5B)。Domain富集分析表明,差异表达蛋白显著富集的结构域有三环状结构域(Kringle domain)和补体分子C3、C4、C5共有的羧基端结构域(UNC-6/NTR/C345C modul
22、e;图 5C)。三环状结构域(Krin-gle domain)在调节蛋白水解活性中起重要作用,具有三环状结构域的蛋白主要有凝血酶原、纤维蛋白溶解酶原、载脂蛋白和凝血因子等。UNC-6/NTR/C345C module与金属锌蛋白家族的锌金属蛋白酶的抑制有关,存在于C3、C4、C5等补体分子中。2.42.4 候选抗性草鱼与对照草鱼差异表达的免疫相关蛋白分析鱼类主要依靠免疫系统抵御病原,部分免疫基因与鱼类抗病力密切关联,因此本研究对显著差异表达的免疫相关蛋白进行了重点分析。结果显示,在候选抗性/对照草鱼组间差异表达的329个蛋白中,总共有118个蛋白与先天性或适应性免疫过程相关;其中59个蛋白在候
23、选抗性草鱼血清中显著高表达,59个蛋白显著低表达。先天性免疫分子先天性免疫分子主要包括补体、细胞因子、抗菌肽及酶类物质等。本研究发现,候选抗性草鱼血清中甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)、补体组分4(C4)、补体组分4b(C4b)、补体组分7b(C7b)、补体组分8b(C8b)、补体组分9(C9)、补体I因子(CFI)、补体组分3a(C3a.1、C3a.2、C3a.3、C3a.6)等补体分子的蛋白表达水平显著高于对照草鱼。此外,候选抗性草鱼血清中细胞因子受体如白介素6受体(IL6ST)、2.502.55.07.510.0logFClg(P value)02468下调Down-r
24、egulated无显著差异N.S.上调Up-regulated 图 3 候选抗性草鱼与对照草鱼血清差异表达蛋白的火山图Fig.3 Volcano map of differentially expressed proteins betweenthe candidate resistant grass carp samples and control grass carpsamples上调代表该蛋白在候选抗性草鱼血清中高表达;下调代表该蛋白在候选抗性草鱼血清中低表达,即在对照草鱼血清中高表达;无差异代表该蛋白在候选抗性草鱼和对照草鱼血清中表达无显著性差异“Up-regulated”means h
25、igher expression in the serum of candidateresistant grass carps;“Down-regulated”means lower expression inthe serum of control grass carps;“N.S.”means no significantdifference between the candidate resistant grass carps and thecontrol grass carps308水 生 生 物 学 报48 卷白介素11受体(EBI3)、介导粒细胞微生物识别及吞噬的癌胚抗原相关细胞黏
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