组织工程技术在开放性脊柱裂产前治疗中的应用.pdf
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1、发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4293组织工程技术在开放性脊柱裂产前治疗中的应用管藤袁正伟魏晓伟 (中国医科大学附属盛京医院卫生部小儿先天畸形重点实验室,辽宁沈阳110004)综述开放性脊柱裂(spina bifida operta,SBA)是一种严重的中枢神经系统先天畸形,由胚胎发育过程中神经管不完全闭合而引起,是最常见的神经管畸形表型之一1,世界范围内人群发生率为1 102。SBA 患者易患后脑疝,经常伴有脑积水、下肢运动障碍、尿便失禁等一系列并发症,需要终
2、身康复治疗,严重影响其心理发育和生活质量1。基于二次打击学说,人们开展了胎儿外科与胎儿镜技术对 SBA 患者进行产前宫内缺损修补治疗,可减少羊水刺激与流体压力引起的二次损伤,使术后继发的脑积水减少 50%,降低了继发性后脑疝的风险,且患者的下肢运动功能有所改善3。然而,由于其对于先天性脊柱裂的原发脊髓发育不良并无治疗作用,术后仍有 30%80%的患儿存在不同程度的神经功能障碍或过早死亡4。目前,超声与分子生物学诊断技术可以使 SBA胎儿在妊娠第 12 周甚至更早时就可以被准确地诊断出来,为 SBA 的早期治疗提供了可能。然而,由于早期胎儿组织的含水量较高且呈凝胶状,不可能通过常规的产前胎儿外科
3、或胎儿镜手术来进行缺损缝合。近年来快速发展的组织工程技术为 SBA早期治疗带来了希望,借助组织工程支架修复 SBA缺陷成为新的研究方向。组织工程的三要素包括支架材料、种子细胞和生长因子,其作用机制是将组织工程支架移植入组织缺损区域,通过直接参与组织再生或通过旁分泌机制间接协助组织再生达到修复缺损和重建功能的目的5-6。SBA 胚胎期治疗干预的理想方式是在不可逆神经损伤形成之前,利用侵入性较小的方式将组织工程支架置于脊髓缺损部位,促进缺损的皮肤、肌肉和神经再生,然后在缺陷处以一层防水组织工程支架覆盖裸露的脊髓,修补组织与神经缺损的同时预防羊水引发的继发性损伤,提高 SBA 胎儿存活率、减轻神经损
4、伤7。本综述主要阐述不同的组织工程支架在 SBA 产前治疗中的应用进展与未来的发展方向。1不同支架材料治疗 SBA支架材料在组织工程中主要通过 3 种方式发挥作用:作为支架运送细胞并诱导局部再生;建立保护组织或移植细胞的屏障;刺激宿主细胞招募、归巢和分化8。主要分为 3 类:天然衍生材料,如胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸、纤维连接蛋白;合成材料,如聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯;从人类或动物器官中制造的脱细胞支架,如小肠黏膜生物基质和无细胞真皮等6。天然衍生材料具有良好的生物相容性、生物降解性和细胞黏附性,但缺点是机械性能差且有可能引发免疫反应;而合成材料更容易进行化学修饰、免疫反应较
5、低,但可能含有毒物质,所以可以将天然生物材料和合DOI:10.3969/j.issn.2095-5340.2023.04.009基金项目:国家自然科学基金(82271753、82171649);辽宁省教育厅基本科研项目(LJKMZ20221154)通信作者:魏晓伟(Email:)294发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4成生物材料结合,从而得到较理想的的生物材料9。根据生物材料的用途和移植后的命运,可以选择生物可降解材料或非生物可降解材料10。用于 SBA产前治疗的
6、组织工程支架应该具备以下特性:具有防水性和水密封性,能够预防羊水引发的继发性脊髓损伤并降低后脑疝风险;能够在裸露的神经与皮肤之间放置,防止黏连;能够联合干细胞或营养因子,刺激缺损区域组织与神经再生。胎儿具有独特的再生能力,自身组织器官中拥有高比例的干细胞,细胞能够快速增殖11。因此,近年来有多项研究探索了利用组织工程支架和生长因子刺激胎儿内源性干细胞在 SBA 患者缺损区域进行组织再生的可行性。目前已经有多种生物材料应用于 SBA 胎儿与动物模型的产前治疗,包括明胶水凝胶、海藻酸钠颗粒、反向热凝胶(reverse thermal gel,RTG)、壳聚糖、人造皮肤以及生物纤维素贴片、非吸水性聚
7、四氟乙烯贴片等各种防水贴片12。1.1可注射的生物材料:明胶明胶水凝胶为天然衍生材料,具有可注射性、可根据组织缺损形成各种形状,并可作为生长因子的缓释载体,宫内注射后并不影响胎儿的存活率。有学者将明胶制备成明胶贴片、明胶海绵与明胶微球不同形式,证实了基于明胶的组织工程支架在SBA胎鼠、胎羊模型中的治疗潜能13。在维甲酸诱导的胎鼠SBA模型中,明胶海绵支架可黏附至SBA缺损区域,并持续释放携带的外源碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),3 d内便可观察到向内生长的组织和新生血管13。研究人员进一步通过宫内手术将明胶贴片、明胶海绵联合bF
8、GF分层放置于妊娠100 d的胎羊脊柱裂部位,妊娠140 d时发现明胶海绵支架已经与周围宿主组织融合,在SBA缺损上形成的新组织层完全覆盖暴露区域,bFGF从支架中持续释放,促进肉芽组织的形成和上皮化,组织学分析显示,经过治疗的胎羊脊髓更厚,灰质和白质受损更小,大大降低了后脑疝的发病率14。即使在羊水环境中,明胶海绵也能黏附在脊髓表面,支持内源性细胞和表皮的生长,并诱导产生相关的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)13。明胶海绵与明胶贴片都需要手术方式植入体内,将明胶材料制成可注射的明胶微球,发现其不仅可以覆盖缺损区域,且支持胎鼠内源性细胞和羊水细胞的黏附与再生,比明
9、胶贴片的治疗效果更好。明胶微球可以通过超声引导注射,手术侵入性更小,更容易实现微创治疗的目的13。需要进一步优化明胶材料来提高对SBA缺损组织的覆盖率,并降低手术侵入性以减少对胎儿的伤害。1.2可注射的生物材料:海藻酸钠海藻酸钠颗粒具有可控的释放生长因子的优势,能在温和的pH值和温度条件下快速凝胶化,具有与组织相似的柔韧性,同时具有黏弹性、间隙流动和类似于天然ECM的扩散传输特性,所以是一种理想的天然支架材料15。海藻酸钠基水凝胶含有大量的水分,可为包裹的细胞提供一个类似生物组织的微环境,同时海藻酸盐基质具有半渗透性,从而允许氧气、营养物质和代谢物的交换,并且能保护包裹的细胞免受有毒物质的伤害
10、16。在SBA的大鼠模型中,羊膜腔内注射含bFGF的海藻酸钠基水凝胶,使其覆盖于SBA缺损部位,保护裸露的神经组织,并通过缓释bFGF促进皮肤再生15。然而羊膜腔内注射bFGF-海藻酸钠颗粒对大鼠以外的其他动物及人类的安全性未知,因此需要在大动物模型中进行更长期、更严格的实验评估其安全性。1.3可注射的生物材料:RTGPSHU-PNIPAm RTG是一种经聚 N-异丙基丙烯酰胺 poly(N-isopropyl acrylamide),PNIPAm 对聚合物主链聚丝氨酸六亚甲基脲 poly(serinol hexamethylene urea),PSHU 进行共轭修饰形成的合成材料,主链PSH
11、U 自身具有模拟 ECM 环境并增强细胞活力的功能17。RTG 在室温下以液体形式存在,在生理环境中由于温度变化会迅速变为稳定的凝胶。体外实验和SBA动物模型体内观察证明RTG可保持其液体-凝胶随温度转变的特性并在羊水环境中稳定地存在,因此适用于宫内SBA的产前治疗18。通过胎儿镜注射RTG治疗SBA,能够在妊发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4295娠早期进行,减少对子宫的侵入性伤害并缩短手术时间18。在Grhl3cre/cre小鼠SBA胚胎模型中,局部注射的RT
12、G在羊水环境中迅速固化形成稳定凝胶覆盖至缺损部位,对SBA胎鼠缺损覆盖率为10%50%。针对RTG对SBA缺损覆盖率不稳定的缺点,下一步应该采取措施增强RTG的黏合性能来提高缺损覆盖率。1.4防水贴片羊膜(amniotic membrane,AM)是胚胎发育时包裹胚胎的内层胎膜,能够为胚胎提供一个湿润的环境使其在生长过程中不受外部结构的压力,具有运输可溶性物质并产生生物活性因子的功能19。AM贴片因为含有干细胞,所以具有很强的再生能力,在胎羊SBA模型中进行自体AM贴片移植,可以促进缺损区域的组织再生与上皮化、抑制上皮细胞凋亡,与单纯的皮肤缺损缝合相比,经AM贴片修复的胎羊损伤部位运动神经元增
13、多、脊髓组织的平均面积增大,并且羔羊脊髓黏连减少,因此其出生后运动功能获得了更好的改善20。但是AM贴片不能完全闭合脊髓缺损区域从而无法阻止脑脊液持续泄漏,因此AM贴片对后脑疝的治疗效果不佳20。人类脐带(human umbilical cord,HUC)贴片来源于冷冻保存的人脐带,能够对SBA缺损部位进行水密闭合来阻止脊髓暴露,同时HUC贴片具有抗炎和再生特性,能够更好地保护脊髓,帮助缺损部位皮肤的再生,移植HUC贴片治疗SBA胎羊能够预防后脑疝,并促进部分膀胱和肢体感觉、运动功能恢复21-22。生物纤维素膜(biocellulose film,BCF)是一种由微生物活动产生的天然材料,在绵
14、羊SBA模型中都已证明BCF具有抑制脊髓黏连、诱导新硬脑膜形成的能力,并且不会导致脊髓栓系23。目前BCF贴片与HUC贴片已经进行了临床应用。1.5应用于临床SBA产前治疗的生物材料Kohl等24在SBA胎儿2223周时通过经皮胎儿镜手术将可吸收贴片与胎儿脊柱裂部位的椎旁肌肉缝合以覆盖暴露的神经组织,然后将不可吸收的聚四氟乙烯贴片铺在上层,并与缺损边缘的皮肤缝合固定。胎儿在母体中生长至32周后,经剖宫产分娩,经手术治疗的SBA患儿脊柱裂部位神经组织被皮肤和贴片材料完全覆盖,腿部运动功能、肠道与肛门功能均接近正常,磁共振成像显示后脑疝逆转。对于缺损比较大的SBA胎儿,无法进行产前或产后原发性皮肤
15、闭合,研究人员通过胎儿镜手术利用BCF贴片或BCF联合双层(硅胶层+真皮基质层)皮肤替代品来闭合脊髓缺损,临床结果发现经过治疗的部分病例后脑疝得以逆转,患儿出生后运动能力得到了改善25-26。同样,人造皮肤和HUC贴片也适用于大面积组织缺损的覆盖,将人造皮肤或冷冻保存的HUC贴片缝合于SBA胎儿脊髓缺损处,胎儿出生后后脑疝发生逆转,无明显脑室肿大,腿部运动功能良好27-28。虽然生物材料已经应用到人类SBA患者的产前治疗,并在很大程度上能够促进其神经功能的恢复,但是手术需要胎儿镜手术辅助,不可避免地增大胎膜早破的风险,从而导致胎儿早产24。2不同干细胞与支架材料联合治疗SBA根据二次打击假说,
16、SBA的病理改变分为两个过程,即神经管形成过程中闭合异常所致的脊髓神经元发育异常是第一次打击;不完全闭合导致脊髓组织周围椎骨缺损、皮肤和软组织的缺少致使脊髓暴露在羊水环境中受到持续的化学刺激与流体剪切力,为第二次打击,属继发性损伤29。单纯支架材料治疗SBA,并不能对原发性的神经损伤进行修复。干细胞具有自我更新和多向分化潜能,有利于损伤神经与组织细胞的再生修复30。快速发育的胎儿组织适合移植干细胞的迁移与分化,而未成熟的免疫系统则降低了异体移植排斥的可能性31。目前,已有多项研究在动物模型中摸索干细胞移植治疗SBA的可行性32-35。用于SBA治疗的多能干细胞主要有间充质干细胞(mesench
17、ymal stem cell,MSC)、神经干细胞(neural stem cell,NSC)、胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)和神经嵴干细胞(neural crest stem cell,NCSC),其中296发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4MSC包括骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem ce
18、ll,BM-MSC)、胎盘间充质干细胞(placental-derived mesenchymal stem cell,PMSC)、脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UC-MSC)、羊水间充质干细胞(amniotic fluid-derived mesenchymal stem cell,AF-MSC)36-38。一项Meta分析从SBA缺损被覆盖的程度、脊髓组织病理学及其功能修复等方面综合评估了ESC、iPSC、NSC、NCSC和MSC对SBA产前治疗的效果,结果显示,在动物模型中进行宫内干细胞移植治疗SBA安全且有效39。由于SBA
19、损伤的脊髓内微环境不利于细胞存活、增殖与分化,单独干细胞移植时,存活在脊髓内的干细胞数量不足以重建损伤的脊髓35,而组织工程支架不但可以对缺损部位进行覆盖以防止继发性损伤,还可以为移植干细胞的存活和增殖提供有益微环境。因此人们开始在动物模型中利用不同支架材料联合不同干细胞产前治疗SBA,以增强单独支架材料或单独干细胞移植的治疗效果,并取得了一定的进展40-41。目前,在SBA产前治疗中应用的组织工程支架主要包括:BM-MSC联合壳聚糖-明胶支架,BM-MSC或PMSC联合ECM贴片,PMSC联合鼠尾胶原凝胶支架,NCSC联合纳米纤维支架,UC-MSC联合纤维蛋白贴片。下面将分别阐述它们的治疗效
20、果。2.1BM-MSC与支架材料联合治疗SBABM-MSC容易获得,可进行自体移植,其多向分化潜能可以促进SBA胚胎受损的骨骼、肌肉、皮肤、神经等多组织的修复。研究证明,在维甲酸诱导的大鼠SBA胚胎模型中移植BM-MSC,移植的干细胞可分化为脊髓修复所需的各种组织细胞,并通过旁分泌作用改善脊髓羊水微环境,减少神经细胞的凋亡,促进神经、皮肤分化来改善胎鼠运动和感觉神经功能,促进缺损组织再生32,42-46。研究将BM-MSC种植于多孔径的壳聚糖-明胶支架中再移植入SBA大鼠模型中,与单独BM-MSC移植相比,壳聚糖-明胶支架可以改善移植干细胞的存活微环境,增强BM-MSC在畸形区域的黏附、存活、
21、增殖及神经分化35。与未治疗的SBA大鼠胚胎相比,采用壳聚糖-明胶支架与BM-MSC联合治疗的SBA大鼠胚胎皮肤缺损面积明显减少,移植的BM-MSC可以迁移到支架外,甚至扩散到整个脊髓缺损区域,这对畸形严重的SBA胚胎的神经、皮肤、肌肉和骨骼等多组织修复有重要意义35。最近一项研究在绵羊模型中也证实了BM-MSC与ECM贴片联合移植对SBA有较好的治疗作用,SBA羔羊经常伴随严重的神经源性肠道功能障碍和神经源性膀胱,这会导致大便失禁或慢性便秘、尿失禁、肾积水以及肾功能衰竭,而肾功能衰竭是SBA致死的主要原因47。未经治疗的SBA胎羊无法做到长期存活,而BM-MSC与ECM贴片治疗组胎羊肠道功能
22、和膀胱功能相关指标比如尿空容量、排尿姿势、肛门直肠压力以及肛门直肠和膀胱肌的厚度等与正常对照的胎羊无明显区别47。2.2PMSC与支架材料联合治疗SBAPMSC可以通过绒毛膜绒毛取样或羊膜腔穿刺术获得,在体外扩增后,可以种植在可降解的组织工程支架上,用于治疗神经系统疾病48-49。妊娠早期的PMSC已被证明具有促进伤口愈合、免疫调节和神经保护的作用,移植的PMSC在绵羊SBA模型中能够保护其定植周围的神经元并改善神经功能50-52。与单独鼠尾胶原水凝胶移植组相比,PMSC联合鼠尾胶原水凝胶支架进行宫内移植治疗SBA胎羊,可增大胎羊脊髓内的神经元密度,且联合治疗组羔羊生后后肢运动功能恢复得更好5
23、3。在SBA胎羊模型中,将PMSC与小肠黏膜下层衍生的ECM联合移植至脊髓缺损区域,能减少脊髓灰质内神经元死亡、促进神经再生并改善SBA羔羊生后的运动功能,且胎羊脊髓内神经元的密度会随着移植的PMSC数量的增加而增大54-55。另有研究证明,将PMSC种植于硬脑膜衍生的ECM中,移植至SBA胎羊脊髓缺损处,PMSC可以迁移扩散到宿主脊髓中存活并分泌细胞活性因子,修复SBA羔羊的运动功能。另外,ECM支架联合PMSC在小鼠SBA模型中的治疗也被证明是安全有效的56。猪小肠黏膜下层衍生的ECM是目前临床应用比较广发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(
24、Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4297泛有效的支架材料,如硬脑膜修复、足和踝关节重建、腹部感染的治疗等34,57-59。有研究探索了PMSC联合猪小肠黏膜下层衍生的ECM组织工程支架对SBA胎羊宫内治疗的可行性,发现经联合治疗的羔羊有63%能够消除行动障碍、自发行走,单独ECM治疗组的羔羊有17%能够自发行走34,可见联合治疗组修复效果明显优于单独ECM治疗组。2021年,一项名为“CuRe试验:子宫内骨髓脊膜膨出修复的细胞疗法”的临床试验首次将干细胞联合组织工程支架应用到人类患者的产前宫内治疗,研究人员将临床应用级PMSC种植于硬脑膜补片上形成
25、干细胞贴片,将制作好的PMSC贴片覆盖在胎儿暴露的脊髓上,随后缝合切口以使组织再生,并在胎儿出生后观察到其下肢具有运动功能60。术后,他们将对手术治疗的患儿进行长达6年的随访,并在患儿30个月时进行关键检查,以便全面评估该疗法的安全性和有效性。2.3UC-MSC联合组织工程支架治疗SBAUC-MSC具有多向分化能力,以及易分离、移植后存活时间长的特点,与骨髓或脂肪来源的MSC相比增殖速度更快、免疫原性更低61-62。已有研究在SBA绵羊模型中观察到经过接种了UC-MSC的纤维蛋白贴片治疗的胎羊脊髓灰质区域及神经元密度增加,说明UC-MSC联合纤维蛋白贴片治疗SBA的有效性63-65。2.4iP
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