中央杏仁核生长抑素阳性神经元参与小鼠急性痒和慢性痒的形态学研究.pdf
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1、Chinese Journal of Neuroanatomy志杂解经部神2023,39(3):2 55 2 6 1中央杏仁核生长抑素阳性神经元参与小鼠急性痒和慢性痒的形态学研究梁怡1.2,饶茜1.2,荆雪,金鑫”,米志宽1*(1.延安大学医学院病理生理学教研室,延安7 16 0 0 0;2 空军军医大学基础医学院神经生物学教研室,西安7 10 0 32;3.空军军医大学基础医学院学员3大队9 队,西安7 10 0 32)摘要目的:观察急性痒和慢性痒小鼠中央杏仁核(CeA)内生长抑素(SST)阳性神经元的激活情况,为其参与痒觉信息的调控提供形态学证据。方法:在小鼠颈背部皮内注射组胺(His)或
2、氯喹(CQ)建立急性痒模型;应用二苯基环丙烯酮(DCP)建立接触性皮炎慢性痒模型。进一步结合免疫荧光染色技术分别观察急性和慢性痒小鼠CeA内SST阳性神经元的激活情况。结果:对照组小鼠30 min内抓挠次数为(16.335.13)次;His组小鼠30 min内抓挠次数为(110.6 6 2 2.0 0)次;CQ组小鼠30 min内抓挠次数为(12 0.3319.50)次。急性痒模型组小鼠抓挠次数显著高于对照组(P0.05);D CP模型组小鼠抓次数明显高于对照组搔抓次数(P0.05)。免疫荧光染色结果显示在急性痒状态下,对照组CeA内SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的(3.10.99
3、)%;H i s 组CeA内SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的(2 0.2 31.7 6)%;CQ组CeA内SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的(19.9 0 2.58)%;在慢性痒状态下,对照组CeA内SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的(3.7 32.0 5)%;DCP组CeA内SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的(2 3.9 34.0 2)%。结论:急性和慢性痒状态下,小鼠CeA内SST阳性神经元激活,为CeA内SST阳性神经元参与痒觉的信息传递提供了形态学依据。【关键词中央杏仁核;生长抑素;急性痒;慢性痒;小鼠D01:10.16557/ki.1000-
4、7547.2023.03.001Morphological study of central amygdala somatostatin positive neuronsinvolved in acute itch and chronic itch in miceLIANG Yil.2,RAO Qianl,24,JING Xue,JIN Xin,MI Zhikuan1*(1.Departent of Pathophysiology,Medicine College of Yanan University,Yanan 716000;2.Department of Neurobiology,Sch
5、ool of Basic Medicine,Air Force Medical University,Xian 710032;3.The 9th Squadron,The 3th Battalion,School of Basic Medicine,Air Force Medical University,Xian 710032,China)Abstract Objective:To observe the activation of somatostatin(SST)positive neurons in the central amygdala(CeA)of mice with chron
6、ic itch and those with acute itch,as well as to provide morphological evidence for itch regula-tion.Methods:The acute itch model was established by intradermal injection of histamine(His)or chloroquine(CQ)on the nape of the neck,while the chronic itch model of contact dermatitis was established usin
7、g diphenylcycloallone(DCP).Immunofluorescence staining was used to evaluate the activation of SST positive neurons in the CeA of mice.Results:The number of scratches in the control group was(16.33 5.13)in 30 minutes,whereas the number ofscratches in the His group and that in the CQ group were(110.66
8、 22.00)and(120.33 19.50),respectively.In基金项目:国家自然科学基金(8 2 0 7 12 35)*通信作者:米志宽电话:0 9 11-2 332 551,E-mail:m i z h i k u a n 16 3.c o m共同第一作者2562023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志,comparison with the control group,scratching times of the CQ group,the His group and DCP group were significantlyhigher(P0.05).The resul
9、ts showed that SST/FOS double-labeled neurons accounted for(3.1 0.99)%of SST-positive neurons in the CeA of the control group in the acute itch.In His group,SST/FOS double-labeled neuronsaccounted for(20.23 1.76)%of SST-positive neurons in CeA.In CQ group,SST/FOS double-labeled neuronsaccounted for(
10、19.90 2.58)%of SST-positive neurons in CeA.In the chronic itch,SST/FOS double-labeled neuronsaccounted for(3.73 2.05)%of SST-positive neurons in the CeA of the control group.In DCP group,SST/FOSdouble-labeled neurons accounted for(23.93 4.02)%of SST-positive neurons in CeA.Conclusion:SST positiveneu
11、rons are activated in the CeA of mice under acute and chronic itch conditions,which provides morphological evi-dence that SST positive neurons are involved in the information transmission of itch sensation.Keywordscentral amygdala(Ce A);s o m a t o s t a t i n (SST);a c u t e i t c h;c h r o n i c i
12、 t c h;m o u s e痒觉是一种引起抓挠欲望的情感体验,常伴搔抓行为。而慢性瘙痒常发生在接触性皮炎、湿疹等多种皮肤疾病和一些系统性疾病当中,严重影响患者的身心健康和生活质量。慢性瘙痒常伴发焦虑和抑郁等情感障碍,而这些情感障碍又会进一步加剧瘙痒,形成恶性循环,患者的抓挠行为会直接导致皮肤状态的恶化及瘙痒的持续,严重影响患者的生活质量1.2 。此前痒觉研究已经取得了重要进展,主要集中在脊髓与外周水平,然而近几年相继发现中央导水管周围灰质(priaqueductalgray,PA G)、中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VT A)、臂旁核(p a r a b r
13、 a c h i a l n u c l e u s,PBN)等脑区也参与了痒觉调控3-5,同时也存在一些局部环路参与了痒觉信息的传递6 ,但对上位中枢参与痒觉调控的研究仍非常有限,呕待开展上位中枢痒觉神经机制和干预策略方面的深人研究,以期为临床慢性痒的治疗提供新靶点。杏仁核位于叶深处,附着于海马体末端,主要负责调控情绪、学习和记忆等。杏仁核包括基底外侧杏仁核(basolateralamygdala,BLA)、中央杏仁核(central amygdala,CeA)和内侧杏仁核(medial amyg-dala,M e A)。C e A 是杏仁核一个重要的信息传出亚区,在情绪处理中发挥重要作用,
14、其结构分为外侧中央杏仁核(lateral division of the central amygdala,CeL)和内侧中央杏仁核(medial division of the cen-tralamygdala,CeM),其神经元类型主要为GABA能神经元7 ,包括表达生长抑素(somatostatin,SST)的SST阳性神经元,表达促肾上腺皮质激素释放因子(c o r t i c o t r o p i n r e l e a s i n g f a c t o r,CRF)的CRF阳性神经元等8 。有文献证实SST阳性神经元在CeA大量表达,参与包括焦虑、抑郁、疼痛信息的处理等多个重要
15、行为9 。有研究表明脊髓中的SST阳性神经元通过作用于脊髓背角的强啡肽能神经元发挥促痒作用10 ,但CeA内的SST阳性神经元在急性痒和慢性痒中的作用仍不清楚。为了深人研究CeA内的SST阳性神经元在急性痒和慢性痒中的作用,本研究建立了组胺(hista-mine,His)、氯喹(chloroquine,CQ)诱发的急性痒模型和二苯基环丙烯酮(diphenylcyclopropenone,D CP)诱发的接触性皮炎慢性痒模型 。运用痒行为视频跟踪系统观察急性痒和慢性痒小鼠的痒行为。同时运用免疫荧光染色技术进一步观察CeA内SST阳性神经元的激活情况,为CeA内SST阳性神经元参与急性痒和慢性痒的
16、调控提供了形态学依据。材料与方法1.材料1.1实验动物选用成年雄性SST-IRES-Cre(stockNo:013044)和Ai9(s t o c k No:0 0 7 9 0 9)小鼠,均购于美国Jackson实验室,后于空军军医大学动物中心繁育两种品系交配的小鼠,经小鼠基因鉴定后,筛选SST阳性且Ai9阳性的小鼠用于本实验研究,用SST:A i 9 表示。温度2 2 2 4,平均湿度50%,12 h光照/12 h黑暗交替循环。所用动物及实验流程均经过空军军医大学动物福利与伦理委员会批准。1.2试剂与仪器器His(Ca t#:H 7 12 5)、CQ(Ca t#:C6628)、D CP(Ca
17、 t#:C6 2 8 9)和4,6-二基-2-苯基吲哚,二乳酸盐(4,6-dia-midino-2-phenylindole,D A-PI)(Ca t#:D 9 56 4)均购自美国Sigma公司;兔抗c-Fos抗体购自美国Cell SignalingTechnology公司(Cat#:2250);A l e x a 48 8 标记的驴抗免抗体购自美国Ab-cam公司(Cat#:a b 150 0 7 3);FV30 0 0 型激光共聚焦显微镜购自日本Olympus公司。2.方法2.1痒模型制备257梁怡:中央杏仁核生长抑素阳性神经息性痒和慢性痒的形态学研究丽2.1.1急性痒模型将成年雄性SS
18、T:A i 9 小鼠分成3组,颈背部剃毛后使用异氟烷麻醉小鼠,皮内注射His(10 g/l)、CQ(10 g/l),对照组皮内注射生理盐水溶液(10 l),使用痒行为视频跟踪系统对小鼠进行痒行为录像,录制30 min后进行计数。2.1.2慢性痒模型将成年雄性SST:A i 9 小鼠分成2 组,使用异氟烷麻醉小鼠后使用脱毛膏对小鼠颈背部进行脱毛处理,裸露颈背部皮肤,3d后初次致敏,将含1%DCP的丙酮溶液涂抹于小鼠颈背部区域,7 d后使用含0.5%DCP的丙酮溶液连续涂抹8d。配药:分别配置含1%DCP的丙酮溶液,含0.5%DCP的丙酮溶液;初次致敏模型组颈背部局部涂抹2 0 0 l含1%DCP
19、的丙酮溶液,7 d后模型组小鼠颈背部局部涂抹2 0 0 l含0.5%DCP的丙酮溶液;对照组小鼠颈背部局部涂抹2 0 0 l的丙酮溶液。在连续涂抹含0.5%DCP的丙酮溶液的第一天开始每天使用痒行为视频跟踪系统对小鼠进行录像,连续8 d,录制30 min后进一步计数每一天的小鼠搔抓次数。2.2灌灌注与取材使用1%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射将小鼠麻醉,充分暴露心脏位置,将针头扎进左心室之后剪掉右心耳,推入0.0 1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)20ml,后推人40 ml含4%多聚甲醛PB溶液,取出脑组织后固定4h再放人含30%蔗糖的PB溶液中脱水。2.3免疫荧光染色分别取急性痒和慢性
20、痒模型组和对照组小鼠各3只,每只小鼠选3张脑片进行c-Fos免疫荧光染色。将脑片在0.0 1mol/LPBS中漂洗310 min后,使用10%的驴血清进行封闭,置于4冰箱中1h,取出待恢复室温后加人兔抗c-Fos抗体(1:150 0)置于4冰箱中孵育36 h;洗片后加人Alexa488标记的驴抗免抗体(1:50 0),室温摇床孵育2.5h。洗片后加人DAPI(1:1000)衬核。使用FV3000型激光共聚焦显微镜进行图像采集。2.4统计学分析使用Graphpad8.0对数据进行统计学分析,采用独立样本t检验、Welchst检验方法,数值均以均值标准误形式表示,P0.05有统计学差异。结果1.成
21、功建立急性痒模型在小鼠颈背部皮内注射His、CQ 建立急性痒模型,对照组注射生理盐水(Fig.1A),待小鼠清醒后放人行为箱中使用痒行为视频追踪系统进行行为录像,录制结束后分别对3组视频进行计数,对照组30min内抓挠次数为(16.335.13)次;His组30 min内抓挠次数为(110.6 6 2 2.0 0)次;CQ组30 min内抓次数为(12 0.3319.50)次,结果显示:His组、CQ组小鼠抓挠次数显著高于对照组(P0.05,Fig.1B)。150ba100ControlHisCQ50ABControlHisCQFig.1 The establishment of acute
22、itch.A:A pattern for intradermal injection.B:Bouts of scratching in mice induced by CQ and His.P0.05 us Control group,bP0.01 us Control group.2.成功建立慢性痒模型在小鼠颈背部涂抹含1%DCP的丙酮溶液初次致敏后,第8 d开始在小鼠颈背部连续涂抹含0.5%DCP的丙酮溶液建立接触性皮炎慢性痒模型,造模成功后对比DCP组和对照组小鼠皮肤状态变化(Fi g.2 A),和对照组相比,DCP组小鼠颈背部脱毛区域皮肤干燥起皮明显,连续涂药后每一天进行痒觉行为录像,
23、分别计数每一天DCP组和对照组小鼠在30min内的抓挠次数。结果显示:第2 d时,DCP组小鼠搔抓次数和对照组相比具有统计学意义,在第7d时,DCP组小鼠搔抓次数达到最高(P0.01,Fig.2B)。2582023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志,400ControlDCPControlDCP300ba200aC100C0AB12345678Time(d)Fig.2 The establishment of chronic itch.A:Skin condition of the chronic itch induced by DCP and the control group.B:The
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