一种高效的甘薯遗传转化方法.pdf
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1、第41 卷第2 期2023年5月文章编号:2 0 9 5-42 9 8(2 0 2 3)0 2-0 0 1 8-0 6江苏师范大学学报(自然科学版)Journal of Jiangsu Normal University(Natural Science Edition)Vol.41,No.2May,2023一种高效的甘薯遗传转化方法张铅,禹阳1,刘帅1,贾赵东,马佩勇1,金昊秀,郭尚洙,边小峰1*(1.江苏省农业科学院粮食作物研究所,江苏南京2 1 0 0 1 4;2.韩国生命工学研究院植物系统工程研究中心,韩国大田30 5-8 0 6)摘要:以甘薯品种苏薯2 4号胚性愈伤细胞为受体材料,建立
2、一种高效的超声波辅助处理的甘薯遗传转化体系,成功将Hpt基因和GFP基因转人愈伤细胞团,获得再生植株,并对所获得的拟转基因株系进行PCR检测.结果显示,此体系转化效率为8 5.4%,成苗率为36.4%,转基因植株阳性率为9 4.9%.关键词:甘薯;胚性愈伤细胞;高效;遗传转化方法中图分类号:S531An efficient method for sweetpotato genetic transformationZhang Qian,Yu Yang,Liu Shuai,Jia Zhaodong,Ma Peiyong,Kim Ho-Soo,Kwak Sang-Soo”,Bian Xiaofeng
3、l*(1.Institute of Food Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,Jiangsu,China;2.Plant Systems Engineer Research Center,Korea Research Institute of Bioscience&.Biotechnology(KRIBB),125 Gwahak-ro,Abstract:An efficient ultrasonic-assisted sweetpotato genetic transformation system w
4、as established using embryo-genic callus aggregates of sweetpotato cultivar Sushu 24 as acceptor material.The Hpt gene and GFP gene weresuccessfully transferred into embryogenic callus aggregates and regenerated plants were obtained,and the obtainedpseudo-transgenic lines were tested by PCR.The resu
5、lts showed that the transformation efficiency of this systemwas 85.4%,the seedling rate was 36.4%and the positive rate of transgenic plants was 94.9%.Key words:sweetpotato;embryogenic callus aggregate;efficient;genetic transformation method甘薯遗传基础复杂且高度杂合(2 n=6=90),存在远缘杂交不亲和性和自交不亲和性,同时许多品种开花困难,产量品质性状与
6、抗性性状高度负相关,再加上甘薯种质资源较乏,病毒病对它危害严重,因此,甘薯常规育种受到严重制约,基因工程技术能够有效克服上述障碍,在甘薯上有着广阔的应用前景.经过多年的发展,甘薯的遗传转化研究取得了一些进展,但仍存在着转化效率低和假阳性率高等问题2 .因此,现有的遗传转化方法仍需进一步改进,以期达到简单、迅速、高效的效果.经过几十年的发展,适合甘薯的遗传转化方法主要包括农杆菌介导法、基因枪法和电激法.基因枪法是通过高速飞行的金属颗粒将包被的目的基因直接导人到受体细胞内,从而实现遗传转化的一种方法.电激法是指利用脉冲电场将DNA导入培养细胞或原生质体的一种遗传转化方法.这2 种方法主收稿日期:2
7、 0 2 2-1 2-30基金项目:国家自然科学基金资助项目(32 1 0 1 7 8 7),江苏省农业科技自主创新基金资助项目(CX(2 2)2 0 1 2),财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系资助项目(CARS-10),江苏省种业振兴揭榜挂帅项目(JBGSC2021J010-2)作者简介:张铅,男,助理研究员,博士,主要从事甘薯遗传育种研究,E-mail:,*通信作者:边小峰,男,副研究员,博士,主要从事甘薯遗传育种研究,E-mail:.文献标志码:AYuseong-gu,Daejeon 305-806,South Korea)doi:10.3969/j.issn.2095-42
8、98.2023.02.004要应用于单子叶植物,在甘薯中也有成功应用的报道,如:Nishiguchi等3成功利用电激法将甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)外壳蛋白基因导人甘薯品种Chikei628-11中,获得了对SPFMV有明显抗性的转基因植株;Lim等4 利用基因枪法将铜锌超氧化物歧化酶基因CuZnSOD和抗坏血酸过氧化物酶基因APX同时转入甘薯中,并成功获得抗氧化性和耐冷性均显著提高的转基因植株.因以上2 种方法所用仪器及耗材较为昂贵,因此,其应用受到了极大的限制.农杆菌介导法主要包括发根农杆菌介导法和根癌农杆菌介导法,是目前植物遗传转化中应用最普遍和最主要的方法,尤其适用于甘薯等双子叶植物
9、发根农杆菌主要以它携带的Ri质粒为载体,将目的基因整合到受体细胞的基因组中.Otani等5 利用发根农杆菌介导法获得了甘薯有效再生植株,Yu第2 期等6 建立了一种发根农杆菌介导的遗传转化体系,成功将IbSOS基因转人甘薯品种徐紫薯8 号的不定根中,但没有得到转基因植株.因发根农杆菌介导体有再生植株困难的缺点,因此,用此方法进行甘薯转化的报道较少.根癌农杆菌主要以它携带的Ti质粒为载体,将目的基因整合到受体细胞的基因组中。在最初的研究中,多以甘薯的叶片、叶柄、茎段作为根癌农杆菌的转化受体,并且成功得到了转基因植株7-1 0 1.但利用这些外植体作为转化材料,存在分化能力及转化效率低等问题.胚性
10、愈伤组织分裂能力强,分化程度低,且在分化培养基上容易再生完整植株,因此,很适合作为根癌农杆菌的转化受体。Gama 等1 1 I首次利用甘薯胚性愈伤细胞作为农杆菌转化受体获得转基因甘薯植株;随后,Kimura 等1 2 将IbGBSS1基因转人甘薯品种Kokei14的胚性愈伤细胞并获得转基因植株;Yu等1 3-1 4 将IbERF4和IbPAL1基因转人甘薯的愈伤细胞中,得到过表达IbERF4和IbPAL1的转基因植株.刘庆昌等1 5建立了使用甘薯胚性悬浮系进行甘薯遗传转化的体系,利用该体系进行多个基因的遗传转化,获得了多个基因的转基因植株,如GUS基因、bar基因的转基因植株及 IbMIPS、
11、I b C 3H 1 8、I b SW EET 1 0、I6C3H18及IbBBX24等基因的过表达植株1 6-2 1.在农杆菌侵染过程中进行超声波处理和真空处理可提高转化效率2 2-2 4.王欣等2 5 利用SAAT(s o n i c a-tion-assisted agrobacterium transformation)法成功将GUS基因转人甘薯品种栗子香的胚性悬浮系,稳定表达率为37.9%.Yang等2 6 在农杆菌侵染胚性悬浮细胞团时进行了真空处理,提高了转化效率.研究表明,使用超声波处理的最高转化率高于使用真空处理的2 7-2 8 ,本研究以苏薯2 4号的胚性愈伤细胞团作为受体进
12、行超声辅助的根癌农杆菌转化,成功获得了转基因植株,提供了一种简单、高效的甘薯遗传转化方法.1材料与方法1.1材料1.1.1供试材料送选用苏薯2 4号的胚性愈伤细胞团作为遗传转化的受体材料,该甘薯品种由江苏省农业科学院选育.试剂:MS培养基(Duchefa)购自青岛百奥百斯特化学试剂有限公司;乙酰丁香酮(Ruibio,A9612)、潮霉素(Ruibio,H O 7 1 5)和头孢霉素(Ruibio,T C 6 51 5)购自合肥博美生物科技有限责任公司;2,4-D(SI G M A,D 7 2 9 9)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;硫酸卡那霉素(Solarbio,张铅,等:一种高效的甘
13、薯遗传转化方法K1030)和利福平(Solarbio,R8011)购自北京索莱宝科技有限公司.1.1.2菌株、质粒及所携带的基因农杆菌菌株为EHA105,含有pCAMBIA1305-GFP质粒.该质粒携带潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phos-photransferase,Hpt)和绿色荧光蛋白基因(greenfluorescent protein,GFP).1.2方法1.2.1培养基配制培养基成分见表1.表1 遗传转化阶段中不同培养基成分Tab.1Different medium compositions in genetictransformation stages遗传转
14、化阶段培养基名称愈伤细胞培养MSD共培养MSDASMSD+150mol/LAS选择培养MSDCHMSD+5/7.5 mg/L Hyg+400/200 mg/LCef分化培养MSCH注:2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸,AS为乙酰丁香酮,Hyg为潮霉素,Cef 为头孢霉素.1.2.2胚性愈伤细胞团的诱导苏薯2 4号胚性愈伤细胞团的诱导参照刘庆昌等1 51 的方法.1.2.3遗传转化与共培养将含有pCAM-BIA1305-GFP质粒的农杆菌EHA105转移至含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin,Kan)和 50 mg/L利福平(rifampicin,Rif)的1 5mLLB液体培养基中振
15、荡培养至D(6 0 0 n m)=0.6 0.8,培养条件为28,转速2 0 0 r/min;菌液常温离心后弃上清液,收集菌体,使用MSDAS液体培养基稀释至D(600 nm)=0.30.5.苏薯2 4号胚性愈伤细胞团在MSD固体平板上进行暗培养(图1 A).在显微镜下挑选继代71 0 d 后,结构致密的愈伤细胞团(图1 B)作为转化材料,剔除结构稀松(图1 C)和非胚性化(图1 D)的细胞团.将挑选的结构致密的愈伤细胞团转人含有农杆菌的离心管中.将离心管用锡箔纸包裹,以遮光,在水平摇床上振荡培养 2 0 min,转速为4060r/min,然后将离心管浸人超声波清洗机(200W,40 k H
16、z)中超声处理1 0 s,最后将愈伤细胞团转移至MSDAS固体培养基(铺有一张滤纸)上,使它均匀分布(图1 E),最后用锡箔纸包裹,以避光,于2 5条件下暗培养3d(图1 F).1.2.4选择培养共培养3d后,用无菌水清洗愈伤细胞团35次,每次2 3min,随后将它转移至Hyg 浓度为 5 mg/L、C e f 浓度为 40 0 mg/L 的MSDCH固体培养基上,在2 5黑暗条件下进行选19遗传转化阶段中所需的各种培养基组分MS+2.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖MS+2.5 mg/L Hyg+200 mg/L Cef20择培养.1 周后将愈伤细胞团转移至Hyg浓度为7.5 mg/L、
17、C e f 浓度为 2 0 0 mg/L的 MSDCH固体培养基上进行选择培养(如将Hyg浓度提高至10mg/L时,则会抑制愈伤细胞团生长,导致愈伤江苏师范大学学报(自然科学版)细胞团不分裂);2 周后再将愈伤细胞团转移至Hyg浓度为5mg/L、C e f 浓度为2 0 0 mg/L的 MSDCH固体培养基上进行选择培养.B第41 卷福EA为MSD固体平板上培养的胚性愈伤细胞团,B、C、D 分别为致密型、稀松型和非胚性化型愈伤细胞团,E为MSDAS固体培养基上被农杆菌侵染过的愈伤细胞团,F为共培养的平板用锡箔纸包裹后暗培养.图1 不同类型的胚性愈伤细胞团及与农杆菌共培养Fig.1Differe
18、nt types of embryogenic callus aggregates and co-culture with Agrobacterium1.2.5分化培养选择培养1 个月后,将选择培养基上正常生长与分裂的细胞团转移到Hyg浓度为2.5mg/L、C e f浓度为2 0 0 mg/L的MSCH固体培养基上,在2 5条件下进行光照培养,光照强度为30001x,光照时间为每天1 4h.1.2.6拟转基因植株的获得及阳性检测将抗性愈伤细胞团置于荧光手电筒下进行荧光检测,激发光波长为440 46 0 nm,保留有绿色荧光的细胞团继续进行分化培养,待分化出体细胞胚后,将它转移到Hyg浓度为 2
19、.5 mg/L、C e f 浓度为2 0 0 mg/L的MSCH固体培养基上.获得转基因植株后,取苏薯24号植株和拟转基因植株的叶片提取总DNA,以提取的总DNA为模板,质粒pCAMBIA1305-GFP为阳性对照,苏薯2 4号总DNA和超纯水为阴性对照,利用Hpt基因特异性引物进行PCR扩增.用于PCR检测的Hpt基因特异引物序列:Hpt-F,5-GGCTCCAACAATGTCCTGA-3;Hpt-R,5-CGGTCGGCATCTACTCTATTT-3.2结果与分析2.1选择培养结果在选择培养基上,没有转入Hpt基因的愈伤细胞团在潮霉素的作用下坏死(图2 A),而成功转人Hpt基因的愈伤细胞
20、团能够正常生长,并且在选择培养基上继续分裂,形成新的细胞团(图2 B、C).荧光检测结果显示,在大部分抗性愈伤细胞团上可以观察到绿色光点(图2 D),表明Hpt基因和GFP基因已整合人愈伤细胞的基因组.2.2分化转绿选择培养1 个月后,将选择培养基上正常生长与分裂的细胞团转移到MSCH固体培养基上进行光照培养后,约2 4周便可分化转绿(图2 E).分化转绿的细胞团经2 4周可分化出体细胞胚(图2 F)。2.3拟转基因植株的获得与阳性检测结果将分化出的体细胞胚转移到MSCH固体培养基上后,经8 1 2 周便可分化出完整植株(图3).据统计,共转化愈伤细胞团1 37 个,其中分化培养基上培养48
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