杨树腐烂病病原菌的分离及拮抗菌的筛选.pdf
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1、1实验材料试剂1.1实验材料(1)病原菌分离的植物材料:采自安图森林经营局岛安林场内,杨树腐烂病发病时期的枝干发病部位。(2)内生细菌的分离材料:采自安图森林经营局岛安林场内健康杨树的根、茎、叶。1.2供试培养基及配方(1)病原菌分离:马铃薯蔗糖培养基(PDA)。马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g、琼脂粉15.0g、水1000mL;(2)内生细菌分离:牛肉膏蛋白胨培养基(NA)。牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂粉15.0g、PH值7.30.1。2研究方法2.1杨树腐烂病病原菌的分离采用组织分离法。于紫外线杀菌30min后的无菌室内进行操作,在超净工作台上将采集的树皮病斑
2、样本清洗干净,用无菌剪刀剪成大小为0.5mm0.5mm的小块,然后进行表面消毒。在无菌玻璃器皿中先用70%酒精浸泡30s,用无菌镊子将病组织块移入0.1%升汞溶液中浸泡3min,然后将升汞溶液倾倒出去,用无菌水洗30s,冲洗4次,尽可能冲去酒精和升汞的残留物。表面消毒结束后,用无菌镊子夹取病组织块摆放于注有PDA培养基的培养皿表,倒置于28恒温培养箱内培养。观察,待长出菌落后,选择不同菌落,挑取菌落边缘的菌丝分别转移至新的PDA培养基平板上继续培养,获得分离菌株。2.2杨树腐烂病病原菌的纯化采用稀释纯化法。将分离出来的不同菌株培养至菌落基本长满平板后,直接在平板内加入少量的无菌水,用无菌接种铲
3、将菌落融入无菌水中,配制成菌悬液,再用无菌水将菌悬液稀释。用显微镜观察,稀释到每个视野中尽量只有一个分生孢子时,把稀释的菌悬液滴入新的PDA培养基平板上,用无菌涂布器均匀涂抹,倒置于28恒温培养箱内培养。依此方法纯化3次后,挑取菌饼置于PDA斜面培养基上培养,待长出菌苔后,将斜面试管移入冰箱4冷藏层保存。2.3分离菌的致病性测定真菌接种孢子悬液的配制:将纯化的真菌在PDA培养基上培养 7d 左右,用 1mL 的无菌水将平板上的孢子冲洗下来,混入20mLPDA液体培养基内,振荡培养(28,180r/min36h),用无菌水稀释至浓度为1.0108个/mL左右的孢子悬浮液。采用离体枝条接种法。取健
4、康新鲜的杨树枝条,先用水把枝条表面冲洗干净,再用70%酒精和0.1%的升汞分别进行表面消毒,无菌水冲洗3次,晾干。将枝条剪成15cm长的小段,两端都用石蜡封好,用无菌接种针在枝条上划出伤口,将制成的孢子悬液涂抹在这些伤口上,以无菌水涂抹做对照。接种后置于无菌托盘内,覆盖无菌湿纱布保湿,再以保鲜膜封好,28保湿培养,分别在6d、8d、10d观察发病情况并记录病斑大小。2.4杨树内生细菌的分离纯化取健康杨树的根、茎、叶,用 70%的酒精表面清洗后,剪成0.51cm的枝段,浸泡在70%的乙醇中1min,再用3.25%的次氯酸钠浸泡15min,用无菌蒸馏水冲洗4次,放置在PDA平板上培养。从上述培养基
5、平板里挑出没长出微生物菌落的(说明表面消毒彻底)部分放入已灭菌的研钵中,加入45mL无菌水,碾碎,搅拌,静止,将上清液涂抹于NA培养基表面,倒置于28的恒温箱中培养,每个处理3次重复。24h后将长出的特征不同的菌落进行划线纯化,此操作进行3次后,获得纯化菌株转至NA斜面培养基,待长出菌落后置于4冷藏保存备用。2.5室内拮抗菌筛选在PDA平板上培养7d的杨树腐烂病菌菌落上,用打孔器打出直径5mm的菌碟,放置于新的PDA平板中间,在距培养皿边缘10mm处点接内生细菌菌株(2个点对称),设只接病原菌的为对照,置于28恒温箱中培养,培养第5天测杨树腐烂病菌菌落宽度,并计算抑菌率。3结果与分析3.1杨树
6、腐烂病病原菌分离及致病性检测对采集回实验室的病树皮进行组织分离后,共纯化出4株真菌,分别编号为F1-4。致病性测定结果显示,在接种6d时,观察,均未有病斑产生;接种8d时观察,F1、F2、F4、菌株与对照一样未表现异常,而F3菌株接种处开始有明显的病斑产生,病斑与杨树腐烂病初期症状一致,也产生酒糟味;接种10d时,F1、F2、F4、菌株与对照仍未有异常表现,F3菌株侵染产生的病斑有明显的扩大。说明分离出的4株菌中只有F3菌株对杨树枝条具有侵染活性,并且产生了与杨树腐烂病一致的症状。按照柯氏法则,将接种发病的杨树枝条再分离,获得的菌株性状与第一次分离到的F3菌株一致,从而确定再次分离的菌株即为杨
7、树腐烂病的病原菌,是下一步实验的病原菌。3.2杨树内生细菌的分离作者简介:张迪(1988.03),男,吉林双辽,汉族,大学本科,营林工程师,营林生产方向,安图森林经营局岛安林场工作。通讯作者:冯爽(1989.04),女,吉林双辽,汉族,大学本科,营林工程师,营林生产方向,安图森林经营局天保管护大队工作。何可(1989.06),女,吉林省通榆县,满族,大学本科,营林工程师,天然林保护部,副部长,营林方向,主要从事天然林保护相关工作,安图森林经营局工作。杨树腐烂病病原菌的分离及拮抗菌的筛选张迪冯爽何可(安图森林经营局吉林 延边州133600)摘要:杨树是我国北方常用的改善生态环境树种,也是国内木材
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