杨树腐烂病病原菌的分离及拮抗菌的筛选.pdf

1实验材料试剂1.1实验材料（1）病原菌分离的植物材料：采自安图森林经营局岛安林场内，杨树腐烂病发病时期的枝干发病部位。（2）内生细菌的分离材料：采自安图森林经营局岛安林场内健康杨树的根、茎、叶。1.2供试培养基及配方（1）病原菌分离：马铃薯蔗糖培养基（PDA）。马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g、琼脂粉15.0g、水1000mL；（2）内生细菌分离：牛肉膏蛋白胨培养基（NA）。牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂粉15.0g、PH值7.30.1。2研究方法2.1杨树腐烂病病原菌的分离采用组织分离法。于紫外线杀菌30min后的无菌室内进行操作，在超净工作台上将采集的树皮病斑样本清洗干净，用无菌剪刀剪成大小为0.5mm0.5mm的小块，然后进行表面消毒。在无菌玻璃器皿中先用70%酒精浸泡30s，用无菌镊子将病组织块移入0.1%升汞溶液中浸泡3min，然后将升汞溶液倾倒出去，用无菌水洗30s，冲洗4次，尽可能冲去酒精和升汞的残留物。表面消毒结束后，用无菌镊子夹取病组织块摆放于注有PDA培养基的培养皿表，倒置于28恒温培养箱内培养。观察，待长出菌落后，选择不同菌落，挑取菌落边缘的菌丝分别转移至新的PDA培养基平板上继续培养，获得分离菌株。2.2杨树腐烂病病原菌的纯化采用稀释纯化法。将分离出来的不同菌株培养至菌落基本长满平板后，直接在平板内加入少量的无菌水，用无菌接种铲将菌落融入无菌水中，配制成菌悬液，再用无菌水将菌悬液稀释。用显微镜观察，稀释到每个视野中尽量只有一个分生孢子时，把稀释的菌悬液滴入新的PDA培养基平板上，用无菌涂布器均匀涂抹，倒置于28恒温培养箱内培养。依此方法纯化3次后，挑取菌饼置于PDA斜面培养基上培养，待长出菌苔后，将斜面试管移入冰箱4冷藏层保存。2.3分离菌的致病性测定真菌接种孢子悬液的配制：将纯化的真菌在PDA培养基上培养 7d 左右，用 1mL 的无菌水将平板上的孢子冲洗下来，混入20mLPDA液体培养基内，振荡培养（28，180r/min36h），用无菌水稀释至浓度为1.0108个/mL左右的孢子悬浮液。采用离体枝条接种法。取健康新鲜的杨树枝条，先用水把枝条表面冲洗干净，再用70%酒精和0.1%的升汞分别进行表面消毒，无菌水冲洗3次，晾干。将枝条剪成15cm长的小段，两端都用石蜡封好，用无菌接种针在枝条上划出伤口，将制成的孢子悬液涂抹在这些伤口上，以无菌水涂抹做对照。接种后置于无菌托盘内，覆盖无菌湿纱布保湿，再以保鲜膜封好，28保湿培养，分别在6d、8d、10d观察发病情况并记录病斑大小。2.4杨树内生细菌的分离纯化取健康杨树的根、茎、叶，用 70%的酒精表面清洗后，剪成0.51cm的枝段，浸泡在70%的乙醇中1min，再用3.25%的次氯酸钠浸泡15min，用无菌蒸馏水冲洗4次，放置在PDA平板上培养。从上述培养基平板里挑出没长出微生物菌落的（说明表面消毒彻底）部分放入已灭菌的研钵中，加入45mL无菌水，碾碎，搅拌，静止，将上清液涂抹于NA培养基表面，倒置于28的恒温箱中培养，每个处理3次重复。24h后将长出的特征不同的菌落进行划线纯化，此操作进行3次后，获得纯化菌株转至NA斜面培养基，待长出菌落后置于4冷藏保存备用。2.5室内拮抗菌筛选在PDA平板上培养7d的杨树腐烂病菌菌落上，用打孔器打出直径5mm的菌碟，放置于新的PDA平板中间，在距培养皿边缘10mm处点接内生细菌菌株（2个点对称），设只接病原菌的为对照，置于28恒温箱中培养，培养第5天测杨树腐烂病菌菌落宽度，并计算抑菌率。3结果与分析3.1杨树腐烂病病原菌分离及致病性检测对采集回实验室的病树皮进行组织分离后，共纯化出4株真菌，分别编号为F1-4。致病性测定结果显示，在接种6d时，观察，均未有病斑产生；接种8d时观察，F1、F2、F4、菌株与对照一样未表现异常，而F3菌株接种处开始有明显的病斑产生，病斑与杨树腐烂病初期症状一致，也产生酒糟味；接种10d时，F1、F2、F4、菌株与对照仍未有异常表现，F3菌株侵染产生的病斑有明显的扩大。说明分离出的4株菌中只有F3菌株对杨树枝条具有侵染活性，并且产生了与杨树腐烂病一致的症状。按照柯氏法则，将接种发病的杨树枝条再分离，获得的菌株性状与第一次分离到的F3菌株一致，从而确定再次分离的菌株即为杨树腐烂病的病原菌，是下一步实验的病原菌。3.2杨树内生细菌的分离作者简介：张迪（1988.03），男，吉林双辽，汉族，大学本科，营林工程师，营林生产方向，安图森林经营局岛安林场工作。通讯作者：冯爽（1989.04），女，吉林双辽，汉族，大学本科，营林工程师，营林生产方向，安图森林经营局天保管护大队工作。何可（1989.06），女，吉林省通榆县，满族，大学本科，营林工程师，天然林保护部，副部长，营林方向，主要从事天然林保护相关工作，安图森林经营局工作。杨树腐烂病病原菌的分离及拮抗菌的筛选张迪冯爽何可（安图森林经营局吉林 延边州133600）摘要：杨树是我国北方常用的改善生态环境树种，也是国内木材生产主要树种之一。杨树腐烂病是一直危害杨树的主要病症。本文从杨树腐烂病入手，分离其病原菌并结合当下对于植物内生细菌的研究，进一步探索植物内生拮抗菌为生物防治提供的有效新思路。对照病菌菌落宽度100%对照病菌菌落宽度-处理病菌菌落宽度抑菌率（%）=10.16627/22-1215/s.2023.03.202250250没有比心更宽的海，没有比信念更高的山！致富路上，蔬菜科技伴君行！蔬菜科技服务新农村致富百姓资源与环境通过对内生细菌的分离，在健康杨树的根、茎、叶中均分离出一定菌群密度的内生细菌，根部菌群密度为1.85104Cfugfw1，茎的菌群密度为1.22104Cfugfw1和叶的菌群密度为1.13104Cfugfw1，可见根部的菌群密度要高于茎和叶部的菌群密度，存在较大差异，总体呈现根部茎部叶部的趋势。从分离出的细菌中找出菌落有差异的菌株进行纯化，共纯化出26株菌株，其中，根部15株（编号为G115）、茎部7株（编号为J17）、叶部4株（编号为Y14）（表1）。3.3杨树腐烂病菌内生拮抗细菌的筛选利用平板拮抗法，筛选杨树腐烂病菌F3的拮抗细菌，从抑菌率来看（见表2），26株菌中，只有G2、G5、G8、G11、G14、J4、J7、Y1这几个菌株有一定的抑菌作用，从杨树不同器官来看，在根、茎、叶分离出的内生细菌中筛选出具有拮抗作用的菌株数量分别为5、2、1，根中所含的拮抗菌数量占总菌数的百分比最高，为19.2%。其中抑菌率50%的有3株菌，分别是G2、G8、G14，均分离自根部，而茎和叶中分离出的细菌具有拮抗活性的菌株数量一方面较少，另一方面表现的拮抗活性也较低。4结论从观察到杨树腐烂病症状的杨树病斑上分离到4株真菌，按照柯氏法则进行致病性测定后，确定F3菌株为病原菌，并从再次发病的病斑上分离到该菌。从健康杨树的根、茎、叶中分离到大量的内生细菌，纯化出26株菌落差异较大的菌株，根部15株、茎部7株、叶部4株。通过平板拮抗，在26株内生细菌中有8株菌对杨树腐烂病菌有抑菌作用，表现出一定的抑菌率，抑菌率50%的菌株菌分离自杨树根部。表2内生细菌的平板抑菌效果拮抗菌数521-分离部位根茎叶对照内生细菌数1574-菌株编号G2G5G8G11G14J4J7Y1-F3菌落宽度（cm）2.67.21.94.53.16.55.26.18.2抑菌率（%）68.312.276.845.162.220.736.625.6-表1杨树内生细菌的分离情况菌株编号G1-15J1-7Y1-4分离部位根茎叶菌群密度/(103Cfugfw1)18.512.211.3分离菌株数1574新时代背景下林业生态建设路径探析纪强（洮南市国有林总场）我国林业正处于生态文明建设一线，并且在生态保护基础上，也随之提出了天然林保护的相关对策。现如今，确保林业生态建设顺利推进中不受影响，发展林下经济就成为当前林业建设重点产业，林业农民的利益也不容忽视。我国林业资源十分丰富，且林业经济在我国国民经济发展中的地位日益提升。传统林业生态建设与林下经济发展过程中，受诸多因素影响，导致林业经济发展存在严重问题，所呈现的效果不尽人意。要依托林业资源为出发点，确保可为从业人员带来更多利益，就需从根本上强化对林业资源的保护，通过种植面积的大幅度扩大，进而实现林下经济全面发展，创建更多的林下产品，适应新时代发展，满足新时代林业生态建设与林下经济发展要求。1林业生态建设的重要意义1.1林业生态建设有利于优化经济发展模式林业生态建设有效促进产业生态化的发展进程，能够更加全面地保护森林资源和野生动植物资源。针对当前生态系统的不足可以合理有序进行完善，提高生态建设水平，推动经济发展模式的转型升级。林业除了提供丰富的资源外，还具有发展第三产业潜力，因此综合价值可观。1.2林业生态建设契合于生态经济发展理念林业生态建设是可持续发展进程中的重要举措。自然资源的使用和保护是否平衡已经成为衡量地区可持续发展的重要指标，社会经济发展应当遵循生态学的相关原理。在生态系统逐步恢复、森林及其生物资源得以完善时，需要给新的生态经济发展创设诸多有利发展的条件。1.3林业生态建设能够为产业生态化目标的实现提供支持注重生态化发展已然是科技前行中极为关键的发展方向：合理利用资源，提高资源的生产率，冲破增长极限，维持生物圈的良性发展。促进经济重组，高质量发展流通经济，在获得足量资金的基础上对生态系统形成全面的防护。发展仿生学，从生物方式的角度出发，以更具生态性的方式进行工业系统的设计，从自然中汲取灵感，转化为科技成果，为可持续发展提供助推力。向自然资本投资，扩宽生态系统的服务范围，以免出现大范围的生态系统破坏问题。污染减排作为约束性指标，已经成为各地政府工作中的重头戏，在当前的工作策略中，应当以工业减排方式为主，但同时需注重减排方式的多元化发展，例如间接减排，其中常见的方法是造林固碳，以低成本的方式取得良好的生态效益。10.16627/22-1215/s.2023.03.203251只有合作，才会成功。吉林蔬菜杂志，圆您致富之梦！吉林蔬菜展示新形象创新发展吉林蔬菜展示新形象创新发展资 源 与 环 境