蛹虫草虫草素合成代谢网络及其关键节点的研究进展.pdf
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1、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 371 蛹虫草虫草素合成代谢网络及其 关键节点的研究进展 曾家鹏,吕梦迪,郑倩望,林俊芳,叶志伟,魏韬*(华南农业大学食品学院,广东省微生态制剂工程技术研究中心,广东广州 510642)摘要:虫草素(Cordycepin)是虫草属(Cordyceps)真菌产生的核心高附加值次级代谢产物之一。与其他工业菌种相比,蛹虫草在腺苷结构类似物(如虫草素)合成方面有天然的代谢通量优势。近年,随着组学分析技术和蛹虫草基因编辑技术的发展,蛹虫草虫草素合成代谢网络,尤其是关键的底物合成途径得到了
2、完整的解析。因此,该综述对目前已知的蛹虫草虫草素合成代谢网络进行了模块化梳理,将其划分为中心碳代谢途径、单磷酸肌苷(Inosinate,IMP)途径和虫草素底物合成途径,并分析了前体物质组成和多个分散途径、关键节点对虫草素合成的影响,系统阐述了 IMP 物质的合成与流向,佐证了 IMP 的合成与代谢是虫草素合成的关键节点,为未来通过代谢工程与合成生物学策略优化蛹虫草虫草素代谢网络、构建稳定高产虫草素的蛹虫草菌株提供相对详实的背景参考。关键词:蛹虫草;虫草素;合成代谢网络;关键节点 文章编号:1673-9078(2023)09-371-379 DOI:10.13982/j.mfst.1673-9
3、078.2023.9.1165 Research Progress on the Metabolic Network of Cordycepin in Cordyceps militaris and Its Key Nodes ZENG Jiapeng,LYU Mengdi,ZHENG Qianwang,LIN Junfang,YE Zhiwei,WEI Tao*(College of Food Science,South China Agricultural University,Research Center for Microecological Agents of Guangdong
4、Province,Guangzhou 510642,China)Abstract:Cordycepin is one of the core high-value-added secondary metabolites produced by fungi belonging to the genus Cordyceps.Compared with other industrial strains,Cordyceps militaris benefits from the innate metabolic flux in the synthesis of adenosine analogs su
5、ch as cordycepin.In recent years,with the development of omic analysis technology and Cordyceps militaris gene-editing technology,the metabolic network of cordycepin synthesis,particularly the key substrate synthesis pathway,has been completely analyzed.Therefore,this review,the known metabolic netw
6、ork of cordycepin is modularized,dividing it into the central carbon metabolic pathway,inosinate(IMP)pathway,and substrate biosynthesis pathway,completely describing its metabolic network.The composition of cordycepin precursor and the influence of multiple dispersion pathways and key nodes on the s
7、ynthesis of cordycepin have been analyzed,and the synthesis and flow direction of IMP substances have been systematically elaborated.This shows that the synthesis and metabolism of IMP is the essential node in cordycepin synthesis.These discoveries provide a comprehensive foundation for optimizing t
8、he metabolism network of Cordyceps militaris through metabolic engineering and synthetic biology strategies,for developing a stable and high-yielding Cordyceps militaris strain in the future.Key words:Cordyceps militaris;cordycepin;metabolic network;key node 引文格式:曾家鹏,吕梦迪,郑倩望,等.蛹虫草虫草素合成代谢网络及其关键节点的研究进
9、展J.现代食品科技,2023,39(9):371-379 ZENG Jiapeng,LYU Mengdi,ZHENG Qianwang,et al.Research progress on the metabolic network of cordycepin in Cordyceps militaris and Its Key Nodes J.Modern Food Science and Technology,2023,39(9):371-379 收稿日期:2022-09-14 基金项目:广东省基础与应用基础研究基金项目区域联合基金-青年基金项目(2019A1515110609);广东东省
10、教育厅科研平台项目(2020KTSCX019);广州市科技协会青年人才托举工程(C20190101019);广东省自然科学基金-面上项目(2022A1515010057)作者简介:曾家鹏(2000-),男,在读硕士研究生,研究方向:食用菌合成生物学,E-mail:;共同第一作者:吕梦迪(1997-),女,硕士,研究方向:食用菌合成生物学,E-mail: 通讯作者:魏韬(1989-),男,博士,讲师,研究方向:食用菌合成生物学,E-mail: 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 372 蛹虫草(Cordyceps
11、militaris)又称虫草花、北冬虫夏草,是虫草科、虫草属真菌,是一种在东亚地区受到广泛欢迎的食药用真菌。蛹虫草在我国分布广泛,野生的蛹虫草以寄生为主,常寄生于鳞翅目幼虫的茧和蛹上或者寄生于昆虫上,产生子座(子实体部分)形成虫蛹复合物,而其子实体是蛹虫草主要食药用部位。蛹虫草中含有高丰度的虫草素(Cordycepin)、多糖、虫草酸等多种生物活性物质,它们所具有的药理特性使蛹虫草的应用场景从食品行业扩大到医疗保健品、医药行列中。虫草素作为蛹虫草产生的核心价值成分之一,也是重要的次级代谢产物,具有抗癌、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性功能。目前虫草素的原材料主要通过蛹虫草液体静置发酵后提取纯化获得
12、,相关菌种选育工作仍停留在采用自然选育等传统研究策略的阶段。经过 40 余年的发展,蛹虫草子实体培养、液体静置发酵技术已经得到了较好的发展,但随着工业化与产业化虫草素的需求逐渐增大,获得高产虫草素的蛹虫草菌株成为了更高效、更可靠的途径。近年,随着组学分析技术和食用菌基因组编辑技术的发展,蛹虫草虫草素代谢途径得到了不同程度的解析,这为构建蛹虫草虫草素合成代谢网络以及蛹虫草代谢工程的理性改造提供了研究基础。因此,本综述对目前已知的蛹虫草虫草素合成代谢网络进行了模块化梳理,将其划分为中心碳代谢途径、单磷酸肌苷(Inosinate,IMP)途径和虫草素底物合成途径,并分析了前体物质组成和多个分散途径、
13、关键节点对虫草素合成的影响,系统阐述了 IMP 物质的合成与流向,佐证了 IMP的合成与代谢是虫草素合成的关键节点,旨在为蛹虫草虫草素代谢工程改造提供理论支持。图 1 虫草素多样化的生物学活性功能 Fig.1 The biological activity function of cordycepin diversity 注:a.抗癌及抗肿瘤效应;b.抗光老化机理;c.虫草素常见的合成方法;d.抗病毒功效;e.抑制肠道病原菌增殖;f.潜在杀虫剂。1 虫草素基本概述 虫草素又称蛹虫草素、虫草菌素,化学名为 3-脱氧腺苷,分子式为 C10H13N5O3,最早于 1951 年由Bentley 等1从
14、蛹虫草中分离获得。过往研究发现虫草素具有多种生物活性功能,因而是虫草属真菌所产生的最具价值的次生代谢产物之一2。虫草素通过阻断mRNA 的延长影响细胞周期正常运转,导致白血病、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 373 乳腺癌等疾病中的病变细胞凋亡(图 1a),从而表现出较好的潜在临床应用价值3;虫草素还可通过抑制NF-B 途径,激活蛋白酶 B 和胞外信号调节激酶,起到抗光老化的作用(图 1b)4,5。基于相同阻断作用,虫草素可抑制病毒复制(图 1d)6,7。此外,虫草素还被发现可通过与 LigA DNA 连接酶
15、的强结合作用,显著抑制梭状芽胞杆菌等肠道致病菌的增殖,却不会对双歧杆菌、植物乳杆菌等益生菌的增殖造成影响 (图 1e)6,符合我国大健康产业发展的需求。基于胃毒作用等潜在机制,虫草素还可对小菜蛾等夜蛾科的农业害虫起到较强的杀灭作用(图 1f)6,有被开发为针对草地贪夜蛾、甜菜夜蛾等其他种类农业害虫的生防制剂的潜能。随着市场上以虫草素为核心成分的保健产品逐渐被开发,虫草素的价值和市场价格近年来逐步攀升。目前,市场上纯度为 90%以上的虫草素的原料价格已高达 25 000 元/kg。目前获得虫草素的原材料主要有两个途径,一是化学合成,二是生物原材料提取。其中,化学合成法最早由 Raylo 化学有限
16、公司于 2000 年成功开发8。由于存在分离手段复杂、生物活度低、底物利用率低(仅为 20%)等问题,该法难以满足原料市场的需求9。目前已知可天然合成虫草素的物种有蛹虫草(Cordyceps militaris)10,11、九州虫草(Cordeceps kyusyuensis)12,13、雪 峰 虫 草(Ophiocordyceps xuefengensis)14,15等。其中,目前对雪峰虫草转录组分析并没有找到所有与虫草素生物合成途径相关的基因16。蛹虫草在卫生部关于批准蛹虫草为新资源食品的公告(2009 年第3 号)和关于批准塔格糖等 6种新食品原料的公告(2014 年第 10 号)中被认
17、定为新资源食品和新食品原料。同时,相关研究表明蛹虫草基因组中未发现任何对人有毒的霉菌毒素基因17,证实了其作为食品的安全性和可食用性。此外,在下表中展示了现有报道的虫草素发酵产量(见表 1),不难发现,在静置发酵的条件下,蛹虫草菌株虫草素产量最高可达6.84 g/L。相较于需要精密高密度发酵设备以及存在高额电费、补料培养基费用的常见代谢工程模式菌种18,蛹虫草在虫草素产量、生产成本、操作简便度等方面均具有较大的工业化生产潜力。目前,包括知名化学试剂供应商 Sigma 和中国药品生物制品检定所所生产的虫草素产品,均是从蛹虫草中提取获得19。表 1 现有报道的虫草素发酵产量 Table 1 Fer
18、mentation yield of cordycepin in current studies 菌种名称 培养方式 虫草素产量 文献 C.militaris CICC 14014 液体静置发酵 5 290 mg/L 20 C.militaris GACP08Y5 液体静置发酵 3 005.83 mg/L 21 C.militaris CGMCC2459 液体静置发酵 2 008.48 mg/L 22 C.militaris NBRC 9787 液体静置发酵 6 840 mg/L 23 C.militaris NBRC 9787 液体静置发酵 2 370 mg/L 24 C.militaris
19、 NBRC 9787 液体静置发酵 640 mg/L 25 C.militaris SIP2 液体静置发酵 2 835 mg/L 26 C.militaris ZA10-C4 液体静置发酵 357 mg/g 27 C.militaris 深层发酵 346.10 mg/L 28 C.militaris 深层发酵 345.40 mg/L 29 Cordyceps kyushuensis 液体静置发酵 978.25 g/g 30 Ophiocordyceps xuefengensis HACM 001 固体发酵 37.10 g/g 31 Y.lipolytica 摇瓶发酵 3 249 mg/L 18
20、 过往受制于寄生宿主的数目和生长环境的特殊性,天然的蛹虫草子实体是难以获得的。直到 80 年代末,人工培养蛹虫草才获得成功19。其后经过 40 余年的发展,培养基组成、培养条件等参数得到完 善32,33,静置菌丝体发酵、振荡菌丝体发酵、固体子实体培养等多种蛹虫草人工培养技术趋于成熟34,35。至 2015 年,我国蛹虫草大规模工厂化种植产量已达到7.4 万 t36,并形成了全球 75%的蛹虫草相关专利。蛹虫草子实体是作为终端商品销售的主要形式,但其栽培过程存在培养周期长、培养基配制成本高、光照培养周期切换模式复杂等问题37。利用人工栽培的蛹虫草子实体来提取虫草素的综合成本仍较高。而蛹虫草液体发
21、酵技术在维持接近室温的恒温条件下培养处于菌丝体状态的蛹虫草,具有培养基配制成本低、培养条件简单、培养周期短、不涉及光照周期诱导“菌丝体-子实体”生长形态切换等优点,可在较短时间内高效生产虫草素。因此,蛹虫草液体静置发酵是目前虫草素原料的主要获得方式。现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 374 为了进一步提高蛹虫草的虫草素合成效率,虫草素合成代谢网络的解析至关重要。1976 年,Kunhorm等38利用基于U-14C腺苷和3-3H的同位素示踪法分析了蛹虫草虫草素上游生物合成路径,明确了腺苷是虫草素合成的关键前体物。
22、其后,Zheng 等17在 2011年首次对蛹虫草进行了全基因组序列测定及标注,CM01 菌株从此成为蛹虫草基因组研究的模式株系。在此基础上,有学者39,40不仅通过转录组测序、蛋白质组测定、代谢组测定等多种组学方法,获得了以葡萄糖、木糖等基础性碳源为前体的虫草素上游及中游合成途径,还通过构建光响应的基因调控网络,验证了光对虫草素合成关键基因的影响。然而即便如此,从腺苷到虫草素的关键底物合成途径在较长时间内仍是未知的。直到 2017 年,Xia 等10通过在蛹虫草中进行基因敲除,并结合靶 DNA 序列在酵母中的异源表达等多种策略,才完成了以腺苷为前体的虫草素底物通道解析,成功补完蛹虫草虫草素合
23、成代谢网络。随着代谢工程与合成生物学的发展,基于天然合成代谢网络的自上而下的菌株改造研究已成为热点。近年来,以蛹虫草为材料的 DNA 元件挖掘、基因编辑技术及基因组代谢模型的开发已取得一定程度的进步41-43。这使得基于蛹虫草和虫草素为核心的代谢工程研究成为可能。而在代谢工程研究中,代谢网络的模块化分割是协助理解和后续改造的核心底层策略。其中,模块间及模块内部引起前体物质分流的分散途径、反馈调节机制的作用位点、易受培养条件改变所影响的柔性节点等,都是菌种改造中的关键目标。本综述结合过往大量的虫草素合成代谢网络分析结果,首次结合代谢工程策略,对蛹虫草虫草素合成代谢网络进行人为分割,并针对各个分隔
24、模块及其中的关键节点进行分析和阐述,并对其未来的改造工作进行了展望。2 蛹虫草虫草素合成代谢网络解析 根据现有的大量蛹虫草虫草素合成代谢网络研究结果,本综述将虫草素合成代谢网络分为 3 个模块进行阐述(图 2),分别是中心碳代谢途径(红色)、IMP途径(蓝色)和虫草素底物合成途径(金色)。图 2 蛹虫草虫草素合成代谢网络 Fig.2 Cordycepin metabolic network in C.militaris 2.1 中心碳代谢途径 现有研究表明,蛹虫草可利用多种糖类分子,如葡萄糖、木糖、核糖等作为前体,经由糖酵解途径、磷酸戊糖途径等途径,最终转化形成虫草素39,44。参照代谢工程细
25、分学科的惯用命名方式,我们将蛹虫草以葡萄糖、核糖和木糖为碳源进行分解代谢获得 5-磷酸核糖的过程,命名为中心碳代谢途径45。2.1.1 糖酵解途径 现有大量研究结果显示,虫草素合成代谢途径的现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 375 初始前体为葡萄糖39,44。葡萄糖被转运至蛹虫草胞内,经磷酸化反应生成 6-磷酸葡萄糖。形成 6-磷酸葡萄糖后,其有两个流向,一部分进入了磷酸戊糖途径,另一部分 6-磷酸葡萄糖经磷酸葡萄糖异构酶催化,转变为 6-磷酸果糖(Fructose-6-Phosphate,F6P)。F6P 进
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- 虫草 合成 代谢 网络 及其 关键 节点 研究进展
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