血耳伴生菌胞外多糖的抗氧化活性及吸湿、保湿性能.pdf
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1、食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2023.17.005基金项目:2019 年湖北省技术创新专项(2019AHB067)作者简介:何林蔓(1999),女(汉),在读硕士研究生,研究方向:食品微生物。*通信作者:李利(1983),女(汉),副教授,博士,研究方向:食品微生物与食品生物技术。血耳伴生菌胞外多糖的抗氧化活性及吸湿、保湿性能何林蔓1,柳宜池1,陈莎1,高梦祥1,2,李利1,2*(1.长江大学 生命科学学院,湖北 荆州 434025;2.长江大学食品研究院,湖北 荆州 434025)摘要:为探讨大型真菌血
2、耳(TremellasanguineaPeng)的伴生菌的活性物质及其开发利用价值,以血耳子实体中分离得到的伴生菌菌株韧革菌(Stereum sp.)XE02 为菌种,利用液态发酵的方法获得发酵液多糖,经脱色、脱蛋白、乙醇沉淀得到胞外粗多糖,得率为(1.1依0.2)g/L。粗多糖经 DEAE-52 纤维素柱层析纯化,得到 1 个中性韧革菌多糖组分(Stereum exopolysaccharides,SEPS)。傅里叶变换红外光谱分析表明,SEPS 具有多糖类物质的一般结构特征,单糖组成为吡喃糖,存在 琢 和 茁 两种类型的糖苷键。抗氧化活性分析表明,SEPS 具有较好的羟自由基和超氧阴离子自
3、由基清除能力,且呈剂量依赖性,在 10 mg/mL 时,清除率分别约为 68%和 74%。SEPS 具有良好的吸湿、保湿性能,在相对湿度 43%、81%的环境下,SEPS 的吸湿率低于甘油,但优于海藻酸钠;在干燥硅胶环境下(相对湿度 0%),SEPS 保湿率优于甘油和海藻酸钠。关键词:血耳伴生菌;韧革菌;胞外多糖;抗氧化;吸湿;保湿Antioxidant Activity,Moisture-absorption and Moisture-retention Properties ofExopolysaccharides from the Associated Fungus of Tremell
4、a sanguineaHE Linman1,LIU Yichi1,CHEN Suo1,GAO Mengxiang1,2,LI Li1,2*(1.College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 434025,Hubei,China;2.Institute of Food Scienceand Technology,Yangtze University,Jingzhou 434025,Hubei,China)粤遭泽贼则葬糟贼:To investigate the bioactive components and their potential
5、 utilization of associated fungus of TremellasanguineaPeng,the strain XE02 of Stereum sp.isolated from the fruiting body of T.sanguineaPeng was used.Theliquidfermentationmethod was employed to obtain fermented polysaccharides from the fermentation broth,whichwere further subjected to decolorization,
6、deproteinization,and ethanol precipitation to obtain crude extracellularpolysaccharides with a yield of(1.1依0.2)g/L.The crude polysaccharides were then purified using DEAE-52cellulosecolumn chromatography,resulting ina neutral Stereum sp.exopolysaccharide fraction(SEPS).Fourier-transforminfraredspec
7、troscopyanalysisshowedthatSEPSexhibitedtypicalstructuralfeaturesofpolysaccharides,with pyranose as the monosaccharide composition and the presence of 琢 and 茁-glycosidic bonds.Antioxidantactivity analysis revealed that SEPS possessed significant hydroxyl radical and superoxide anion radicalscavenging
8、 abilities,with dose-dependent effects.At a concentration of 10 mg/mL,the scavenging rates wereapproximately 68%and 74%,respectively.SEPS demonstrated excellent moisture-absorption and moisture-retention properties.Under relative humidity conditions of 43%and 81%,SEPS exhibited lower moistureabsorpt
9、ion than glycerol but higher than sodium alginate.In a dry silica gel environment(0%relative humidity),SEPSshowed bettermoisture retentionthan glycerol andsodium alginate.运藻赠 憎燥则凿泽:associated fungus of Tremella sanguinea;Stereum sp.;exopolysaccharides;antioxidant;mois原ture-absorption;moisture-retent
10、ion基础研究30食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期血耳(TremellasanguineaPeng),又称血银耳,是一种生长于枯木上的药食兼用大型胶质真菌,子实体以耳片状丛生,鲜时呈暗赤褐色,干后黑色,浸水后渗出琥珀红色色素,故称血耳1。血耳作为食药兼用真菌,在湖北省西北部山区具有较长栽培历史,具有益气活血、平肝阳、祛热毒的功效,常用于肝炎、痢疾以及妇科诸症的治疗2。1990 年彭寅斌根据血耳的形态特征对其进行分类,将其归属于银耳纲(Tremellomycetes)、银耳目(Tremellales)、银耳科(Tremellaceae)、银耳属(Tremel原la)1,
11、与常见的食用菌银耳(T.fuciformis)、金耳(T.au原rantialba)同属,亲缘关系较近。银耳属真菌中普遍存在伴生现象3。血耳、金耳、脑状银耳(T.encephala)、T.spectabilis 和 T.steidleri 的伴生菌被鉴定为韧革菌(Stereum sp.)3-5,银耳的伴生菌为香灰菌(Hypoxylonsp援)3,T.mycophaga、T.obscura 和 T.giraffa的伴生菌为花耳属真菌(Dacrymyces sp.)4。银耳属的这种伴生现象实质为一种寄生关系,银耳属真菌为寄生菌,伴生菌为宿主菌。伴生菌具有较高的纤维素、半纤维素降解能力,能够分解木材
12、,为银耳属真菌的生长发育提供营养和水分3-5。研究发现,许多银耳属的子实体是一种异质复合体,含有大量的伴生菌菌丝3-4。银耳属食用菌中多糖含量极其丰富,被认为是其主要的活性成分,其中关于银耳多糖和金耳多糖的研究较多,被证实具有调节免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、抗衰老、降血糖、减肥及益生等多种功效6-7,开发利用前景十分广阔。近年来。血耳子实体多糖的抗氧化、抗炎症和调节免疫功能的活性也已被报道8-10。食用菌多糖不仅可以从子实体中提取和分离,还可以从培养的菌丝体、孢子或发酵液中获取11。目前银耳属食用菌多糖的研究主要集中于子实体多糖和菌丝体、担孢子发酵产生的多糖,对其伴生菌多糖的研究鲜有报道1
13、2。本研究利用血耳伴生菌菌株韧革菌XE02 进行液态发酵制备胞外多糖,对多糖的抗氧化活性及吸湿、保湿性能进行研究,以期为血耳伴生菌活性物质的开发利用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂血耳伴生菌菌株韧革菌(Stereum sp.)XE02,通过耳木组织培养法从湖北省保康县马良镇水田村采集的血耳子实体中分离而得5。葡萄糖、浓硫酸、苯酚、水杨酸、邻苯三酚、甘油、抗坏血酸(vitamin C,VC)、海藻酸钠(均为分析纯)、KBr(光谱纯):国药集团化学试剂有限公司;DEAE-52 纤维素:上海源叶生物科技有限公司。马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基:马铃薯
14、 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂 15 g,定容至1 000 mL;马铃薯培养基13:马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,KH2PO43 g,MgSO41.5 g,定容至 1 000 mL,pH6.0;大米培养基14:大米粉 40 g,大豆粉 10 g,KCl 0.15 g,KH2PO40.15g,NaCl 0.15 g,定容至 1 000 mL,pH6.0;葡萄糖培养基:葡萄糖 50 g、蛋白胨 5 g、KH2PO42.5 g,MgSO41.0 g,定容至 1 000 mL,pH6.0;加富葡萄糖培养基:在葡萄糖培养基的基础上添加 0.15%酵母浸出粉。培养基灭菌条件为 121 益,2
15、0 min。1.2仪器与设备Allegra X-30R 离心机:德国贝克曼公司;TU1900紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;HT7800 透射电子显微镜:日本日立科学仪器有限公司;IR-960 傅里叶红外变换光谱仪:天津瑞岸科技有限公司;Waters 1515 高效液相色谱仪、Waters 2410示差折光检测器:美国沃特世公司。1.3方法1.3.1血耳伴生菌的液态发酵将韧革菌 XE02 点接于 PDA 培养基,30 益培养 4 d进行活化。挑取 5 块 4 mm2大小的菌饼接入 50 mL 液体培养基,30 益,200 r/min 培养 3 d 得到种子液,再按照 10%接
16、种量转接至液体培养基中进行扩大培养,培养条件为 30 益、200 r/min、7 d。1.3.2胞外粗多糖的提取发酵结束后,发酵液经真空抽滤除掉菌丝体,收集滤液,于 55 益减压浓缩至原体积的 1/10,按 100 颐 5的体积比加入 30%H2O2,用 1 mol/L NaOH 溶液调节pH值至 9,在 40 益下水浴 1 h 进行脱色,得到澄清透明的粗多糖溶液。加入 1/4 体积的 Sevag 试剂(氯仿 颐 正丁醇=4 颐 1,体积比),磁力搅拌 20 min 后,10 000 r/min 离心 15 min,脱除蛋白质,重复 3 次,收集上清液,加入无水乙醇,使体系中乙醇体积浓度达到
17、80%,4 益静置过夜,10 000 r/min 离心 15 min,获得粗多糖沉淀。将粗多引文格式:何林蔓,柳宜池,陈莎,等.血耳伴生菌胞外多糖的抗氧化活性及吸湿、保湿性能J.食品研究与开发,2023,44(17):30-36.HELinman,LIUYichi,CHENSuo,etal.AntioxidantActivity,Moisture-absorption and Moisture-retention Properties of Exo-polysaccharides from the Associated Fungus of TremellasanguineaJ.Food Res
18、earch and Development,2023,44(17):30-36.基础研究31食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期糖沉淀用无水乙醇洗涤2 次,加入蒸馏水溶解,冷冻干燥后得到粗多糖。粗多糖的得率(P,g/L)按公式(1)进行计算。P=M粗多糖V(1)式中:M粗多糖为粗多糖的干燥后质量,g;V 为用于提取多糖的发酵液体积,L。1.3.3多糖的分离纯化0.1 g 粗多糖溶解在 10 mL 蒸馏水中,上样至DEAE-52 纤维素层析柱(2.6 cm 伊 45 cm),依次用 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl 溶液进行洗脱,流速为1 m
19、L/min,每 7 mL 洗脱液收集一管。采用苯酚-硫酸法测量洗脱液的吸光值(A490nm),绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线将主要峰对应的洗脱液合并,依次进行减压浓缩、透析、冷冻干燥,得到韧革菌多糖组分(Stereum ex原opolysaccharides,SEPS)。1.3.4紫外可见吸收光谱测定将多糖样品配制成质量浓度为 2 mg/mL 的水溶液,在 200600 nm 波长内,以 1 nm 间隔进行扫描。1.3.5高效凝胶渗透色谱测定配制质量浓度为 5.0 mg/mL 的右旋糖酐标准品(分子量 1 000、5 000、12 000、25 000、50 000、80 000、670 000
20、Da)和 SEPS 溶液,过 0.22 滋m 微孔滤膜后采用高效凝胶渗透色谱法进行测定。采用示差折光检测器;色谱柱为 Shodex OHpak SB-803 HQ、Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-805 HQ(8 mm伊300 mm)串联柱;流动相为 0.05 mol/L NaCl 水溶液;流速 0.6 mL/min;柱温40 益,进样量 30 滋L。采用 Waters Empower 软件对结果进行分析,以标准品相对分子质量(molecular weight,Mw)的对数值为纵坐标,以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归,得校正曲线。根据多糖组分的保留时间由校正曲线计算
21、得到其分子量。1.3.6傅里叶变换红外光谱测定多糖样品 12 mg 与 KBr 固体充分研磨后压片,在 4 000400 cm-1的波数范围内进行扫描。1.3.7透射电子显微镜观察参照王昭晶等9的方法,具体如下:1 mg/mL 的多糖水溶液,按质量比 1 颐 1 加入 1 mg/mL 十二烷基硫酸钠溶液,80 益恒温水浴 2 h,用蒸馏水稀释至 5 滋g/mL,80 益继续水浴 2 h。取 1 滴分散好的多糖溶液加到 300目铜网碳膜上,室温下自然干燥后在 80 kV 电压下进行观察。1.3.8抗氧化能力测定参照 Zhang 等15的方法测定多糖样品的羟自由基清除能力,以 VC为阳性对照。将
22、1.0mLFeSO4(9 mmol/L)、1.0 mL 水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L)和 1.0 mL多糖样品(010 mg/mL)混合。加入 1.0 mL H2O2(8.8 mmol/L)启动反应,37 益的水浴孵育 1 h,测定 510 nm 处吸光值,按照公式(2)计算羟自由基清除率(Sh,%)。Sh=(1-A1-A2A0)伊100(2)式中:A1为样品溶液的反应体系的吸光值;A2为用乙醇代替水杨酸-乙醇溶液的对照组吸光值;A0为用蒸馏水代替样品溶液的对照组吸光值。参照 Feng 等16的方法测定多糖样品的超氧阴离子自由基清除能力,以 VC为阳性对照。将 3.0 mL Tris-H
23、Cl 缓冲液(0.05 mol/L,pH8.2,含 1 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠)于试管中,25 益水浴孵育 20 min,取出后立即加入 2.0 mL 样品溶液(010 mg/mL)和 1.0 mL 邻苯三酚(50 mmol/L),混匀,25 益水浴反应 5 min,然后加入 0.2 mL 浓盐酸终止反应,于 320 nm 处测吸光值,按照公式(3)计算超氧阴离子自由基清除率(Ss,%)。Ss=(1-A1-A2A0)伊100(3)式中:A1为样品溶液的反应体系的吸光值;A2为用蒸馏水代替邻苯三酚溶液的对照组吸光值;A0为用蒸馏水代替样品溶液的对照组吸光值。1.3.9吸湿、保湿效果测定按
24、伍晓萍等17的方法,以常用的保湿剂甘油和海藻酸钠为对照,考察多糖的吸湿、保湿能力。称取多糖样品、甘油和海藻酸钠各 0.5 g 于称量瓶中,将其放入置有饱和碳酸钾溶液(相对湿度 43%)和饱和硫酸铵溶液(相对湿度 81%)的干燥器内,25 益放置 2、4、6、8、10、12、24 h 后,分别称量样品质量,按公式(4)计算吸湿能力(Ma,%)。Ma=W1-W0W0伊100(4)式中:W0为初始样品质量,g;W1为特定时间吸湿后的样品质量,g。称取多糖样品、甘油和海藻酸钠各 0.5 g 于称量瓶中,分别加入 3 倍样品质量的去离子水,转动称量瓶直至样品将水分完全吸收。将称量瓶放入装有变色硅胶的干燥
25、器(相对湿度 0%)内,25 益放置 2、4、6、8、10、12、24、36 h 后,分别称量样品质量,按照公式(5)计算保湿率(Mr,%)。Mr=H1H0伊100(5)式中:H0为初始样品中的水分质量,g;H1为特定时间后样品中的水分质量,g。1.4数据处理与分析采用 Excel 2007 处理数据和统计分析,Origin2018 软件进行绘图。试验数据均重复测定 3 次。基础研究32食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期2结果与分析2.1血耳伴生菌胞外多糖的发酵制备韧革菌 XE02 在马铃薯培养基、大米培养基、葡萄糖培养基和加富葡萄糖培养基中进行液态发酵,其发酵液中多糖
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