上海主养区凡纳滨对虾8种流行病病原监测及分析.pdf
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1、doi:10.16446/j.fsti.20230400112 收稿日期:2023-04-12 作者简介:张小明(1990),男,助理工程师,研究方向为水生生物疫病防控。E-mail:xmzhangwork 通信作者:张明辉(1978),男,高级工程师,研究方向为水生生物疫病防控。E-mail:mhzhang0907 项目资助:上海市现代农业产业技术体系沪农科产字(2022)第 5 号。上海主养区凡纳滨对虾 8 种流行病病原监测及分析 张小明 安伟 张明辉(上海市水产研究所,上海市水产技术推广站,上海 200433)摘 要:为进一步掌握上海地区养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vanna
2、mei)病原的流行趋势及特点,定期对上海主养区的凡纳滨对虾开展了 8 种流行病病原监测及分析工作。51 份样品的分子检测和细菌分离鉴定结果显示,有 4 种病原检测出阳性,其中虹彩病毒 1(DIV1)阳性检出率为 29.41%,传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)为 3.92%,致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)为 1.96%,副溶血弧菌(Vp)为19.61%;而白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾肝肠胞虫(EHP)等 4 种病原未检出。408 项病原检测结果中,4 种病原的阳性总样本数量为 28 份,总体阳性率为6.86%。结果
3、表明,上海地区养殖凡纳滨对虾的病原携带率处于较低水平,DIV1、副溶血弧菌(Vp)是携带的主要病原。在实际生产中应根据病原流行特点,从苗种选购、养殖过程管理、药物选用等方面进行综合防控,减少病害发生。关键词:凡纳滨对虾;十足目虹彩病毒 1(DIV1);致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND);副溶血弧菌(Vp);传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV);虾肝肠胞虫(EHP)凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾,原产于南美洲太平洋沿岸,因其营养丰富、肉味鲜美、适应盐度范围广等优点,目前已成为我国重要的水产养殖品种1。但近年来,在凡纳滨对虾养殖过程中常常暴发
4、流行性疾病,如急性肝胰腺坏死病1、虾虹彩病毒病2、白斑综合征3、桃拉综合征4、传染性皮下及造血组织坏死病5、偷死野田村病6和虾肝肠胞虫病7等,导致养殖产量严重下滑,对对虾养殖业发展构成了严重威胁。虾虹彩病毒病是一种感染甲壳类的急性、传染性疾病,病原为十足目虹彩病毒 1(DIV1),简称虹彩病毒,患病的凡纳滨对虾表现为空肠空胃、肝胰腺萎缩、颜色变浅、停止摄食、活力下降等症状。DIV1 病毒 2014 年首次在浙江某养殖场的凡纳滨对虾中被发现,近年来,已陆续在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、红 螯 螯 虾(Cherax quadricarinatus)等虾类体内被发
5、现,其传播速度快,宿主范围广、致死率高,给我国对虾养殖业造成了巨大的经济损失8。传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)可感染世界各地的养殖对虾,感染凡纳滨对虾后会引起慢性“矮小残综合症”,患病对虾生长缓慢,畸形,受感染的对虾终生携带病毒,并进行垂直和水平传播9。弧菌属于条件性致病菌,在条件适宜的情况下,弧菌病具有流行广、发病率高、危害大、死亡率高等特点。安伟等10的研究结果显示,上海凡纳滨对虾主养区以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)诱发的疾病为主,其中以急性肝胰腺坏死病(AHPND)的危害最为严重。该病的病原菌主要是携带5322023,50(4)水产科技情
6、报(Fisheries Science&Technology Information)pirAvp和 pirBvp基 因 的 变 种 副 溶 血 弧 菌(VpAHPND),患病的对虾摄食减少,空肠空胃,肝胰腺萎缩、发白,虾壳松软,死亡率高达 90%以上1。弧菌病已给多国对虾养殖业带来了巨大的经济损失。普通副溶血弧菌(Vp)虽然没有变种弧菌引起的危害严重,但仍能引起一些对虾发病,需加强病原监测。凡纳滨对虾是上海市水产养殖的主要品种,2022 年养殖面积约 2 738.87 hm2,主要集中在奉贤区、金山区等郊区11。近年来,水产养殖业因病害造成的经济损失以凡纳滨对虾养殖最为严重,病害问题是凡纳滨
7、对虾养殖生产过程中的突出问题。因此,加强凡纳滨对虾养殖生产的流行病病原监测,及时、准确地掌握和诊断病原携带情况,尽快采取有效应对措施是保证对虾健康和生态养殖的关键。为掌握上海地区养殖凡纳滨对虾主要流行病病原的携带情况,本研究于 2022 年 3月2023 年 3 月,定期对上海主养区的凡纳滨对虾开 展 Vp、Vp AHPND、DIV1、白 斑 综 合 征 病 毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、IHHNV、偷死野田村病毒(CMNV)、虾肝肠胞虫(EHP)等 8 种病原的监测及分析,以期为上海地区虾病防控、健康养殖提供参考,为制定科学合理的防控对策提供依据。1 材料和方法1.1 主要试剂T
8、aKaRa miniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(9766)提取试剂盒、PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)、PCR Premix Taq、DNA Marker 均购自宝生生物工程(大连)有限公司;胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)、3%碱性蛋白胨水均购自北京陆桥技术有限公司。1.2 样品采集2022 年 3 月2023 年 3 月,定期采集上海郊区的3 个凡纳滨对虾主养区(A、B、C)的5 个养殖场(a、b、c、d、e)养殖的凡纳
9、滨对虾,从放苗到养殖过程中持续采样,共采集 51 份样品,其中 A 区16 份,B 区 31 份,C 区 4 份。按照世界动物卫生组织(OIE)规定的抽样比例12,随机抽取一定数量的凡纳滨对虾样品,每批次样品不少于 150 尾。一部分样品用 95%乙醇固定保存,用于后续的分子检测;一部分活体样品则运至实验室用于弧菌的分离鉴定。1.3 副溶血弧菌(Vp)的分离、鉴定及保存采用平板分离方法:无菌剖取肝胰脏,取 1 g组织混样置于 10 mL 的 3%碱性蛋白胨水中,30 培养 18 h 后,分别在 TCBS 培养板上划线培养,1824 h 后观察菌落特征。挑取具有典型弧菌特征的单菌落,接种到TSA
10、 培养平板上划线培养 1824 h,用无菌接种环挑取单菌落,接种到 3 mL 灭菌的 0.45%生理盐水,最终配成菌液浓度在 0.50 0.64 麦氏度后,再用 VITEK2 Compact 全自动细菌鉴定仪进行分析鉴定。将已鉴定的副溶血弧菌(Vp)单菌落再次纯化,接种到 3%碱性蛋白胨水中增菌培养 18 24 h,用甘油(最终体积分数为 20%)于-80 保存备用。1.4 病原的分子检测1.4.1 核酸提取取 50 mg 虾组织匀浆液,参照 RNA/DNA 提取试剂盒说明书的方法进行核酸提取,于-80 保存备用。1.4.2 PCR 检测以提取的 DNA 或 RNA 为模板,分别进行PCR 检
11、测。DIV1、WSSV、IHHNV、EHP 和 VpAHPND的 PCR 反应体系为 25.0 L:Premix Taq 12.5 L,上、下游引物各 1.0 L,DNA 模板 2.0 L,无菌 ddH2O 8.5 L,设置 ddH2O 为阴性对照模板。套式 PCR 以第一轮 PCR 产物为模板加 1.0 L。TSV 和 CMNV 的 PCR 反应体系为 25.0 L:2 1 Step Buffer 12.5 L,PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 L,上、下游引物各1.0 L,RNA 模板 2.0 L,无菌 ddH2O 7.5 L。套式 PCR 反应体系:Prem
12、ix Taq 12.5 L,上、下游引物各 1.0 L,第一轮 PCR 产物模板 1.0 L,无菌 ddH2O 8.5 L。检测 7 种病原的引物和方法具体见表1,文献中的引物与国标引物相同。反应结束后,取 6 L 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,并在凝胶成像系统拍照。PCR 阳性扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。632水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(4)表 1 7 种凡纳滨对虾病原名称和引物病原名称引物名称引物序列(53)产物长度/bp参考文献十足目虹彩病毒 1(DIV1)DIV1-F1
13、GGGCGGGAGATGGTGTTAGATDIV1-R1TCGTTTCGGTACGAAGATGTADIV1-F2CGGGAAACGATTCGTATTGGGDIV1-R2TTGCTTGATCGGCATCCTTGA4571292白斑综合征病毒(WSSV)WSSV-F1ACTACTAACTTCAGCCTATCTAGWSSV-R1TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGAWSSV-F2GTAACTGCCCCTTCCATCTCCAWSSV-R2TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT1 4479413桃拉综合征病毒(TSV)TSV-FAAGTAGACAGCCGCGCTTTSV-RTCAATG
14、AGAGCTTGGTCC2314传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)IHHNV-FCGGAACACAACCCGACTTTAIHHNV-RGGCCAAGACCAAAATACGAA3899对虾偷死野田村病毒(CMNV)CMNV-F1AAATACGGCGATGACGCMNV-R1ACGAAGTGCCCACAGACCMNV-F2TCCCGTATTCGTGGATCMNV-R2TAGGGTCAAAAGGTGTAGT6194136虾肝肠胞虫(EHP)EHP-F1TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTEHP-R1CACGATGTGTCTTTGCAATTTTCEHP-F2TTGGCGGCACAAT
15、TCTCAAACAEHP-R2GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA5141477致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)AP4-F1ATGAGTAACAATATAAAACATGAAACAP4-R1ACGATTTCGACGTTCCCCAAAP4-F2TTGAGAATACGGGACGTGGGAP4-R2GTTAGTCATGTGAGCACCTTC1 26923012 结果与分析2.1 检测结果经 PCR 检测分析,2022 年 3 月2023 年 3月采集的 51 份凡纳滨对虾样品中,携带 DIV1 病毒的 15 份(见 图 1),携 带 VpAHPND的 1 份(见图 2),携
16、带 IHHNV 的 2 份,阳性检出率分别为 29.41%、1.96%、3.92%。WSSV、TSV、CMNV、EHP 等 4 种病原未检出;经平板划线分离到副溶血弧菌(Vp)10 株,阳性检出率为 19.61%。注:M.DL 1 000 DNA Marker;113.检测样品;N.阴性对照;P.阳性对照。图 1 部分凡纳滨对虾样品 DIV1 的 PCR 扩增结果 注:M.DL 2 000 DNA Marker;110.检测样品;N.阴性对照;P.阳性对照。图 2 部分凡纳滨对虾样品 VpAHPND的 PCR 扩增结果 8 种流行病的 408 项病原检测结果显示,DIV1、IHHNV、VpAH
17、PND 和 Vp 这 4 种病原的阳性总样本数量为 28 份,总体阳性率为 6.86%。其中DIV1 阳性率占比最高,为 29.41%,Vp 次之,为19.61%,VpAHPND和 IHHNV 阳性率较低,分别为1.96%和 3.92%;其余 4 种病原未检出(见表 2)。7322023,50(4)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)表 2 凡纳滨对虾病原检测结果统计序号检测病原名称样品数量/份阳性数量/份阳性率/%1白斑综合征病毒(WSSV)51002桃拉综合征病毒(TSV)51003传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)512
18、3.924虾肝肠胞虫(EHP)51005虾虹彩病毒(DIV1)511529.416偷死野田村病毒(CMNV)51007致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)5111.968副溶血弧菌(Vp)511019.61合计408286.862.2 不同区域检测情况从 51 份凡纳滨对虾样品的病原携带情况分析,养殖场 a、b 主要携带 DIV1 和 Vp,养殖场 c 主要携带 DIV1 和 VpAHPND,养 殖 场 d 主 要 携 带DIV1,养殖场 e 携带 DIV1 和 IHHNV。5 个养殖场同时携带 DIV1,而仅在 1 个养殖场的 1 份样品中检测到 VpAHPND,另 1 个养殖场的
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