羧肽酶A4调控三阴性乳腺癌干性及上皮-间质转换的机制.pdf
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1、论著羧肽酶A 4调控三阴性乳腺癌干性及上皮-间质转换的机制*李映东1 王铁延2 欧琴1 章书铭1 李文仿1(湖北医药学院附属太和医院1.乳腺甲状腺中心;2.病理科,湖北 十堰 4 4 2 0 0 0)【摘要】目的 探讨三阴性乳腺癌(TN B C)中羧肽酶A 4(C P A 4)的表达及临床病理意义。方法 收集我院2 0 1 9年1月2 0 2 1年1 0月手术切除经临床病理诊断确诊的T N B C早期患者1 6 8例,同期非T N B C共4 0例,同期乳腺包块切除后诊断乳腺增生组织2 0例。用免疫组化方法检测T N B C组织中C P A 4,干性相关蛋白醛脱氢酶1、NANOG,上皮-间质转
2、换(EMT)相关蛋白E-c a d h e r i n、V i m e n t i n表达。分析1 6 8例T N B C中C P A 4表达与临床病理指标关系。敲除MD A-MB-2 3 1细胞中C P A 4(s i C P A 4),观察对细胞克隆形成、细胞成球、侵袭及迁移影响,W e s t e r n B l o t检测相关蛋白表达。结果 T N B C组织中C P A 4表达率5 7.1 4%,明显高于非T N B C的3 7.5%,差异有统计学意义(2=5.0 0 9,P=0.0 2 5),T N B C中C P A 4表达明显高于乳腺增生组织的2 0%,差异具有统计学意义(2=
3、9.8 5 0,P=0.0 0 2)。TN B C中C P A 4表达与患者年龄、绝经状态、脉管浸润、肿瘤大小、组织学分级、T NM分期差异无统计学意义。C P A 4阳性组淋巴结转移率为5 9.4%,C P A 4阴性组淋巴结转移率为3 8.9%,差异具有统计学意义(2=6.9 0 8,P=0.0 0 9)。C P A 4阳性组K i-6 7为8 4.4%,而C P A 4阴性组K i-6 7为7 0.8%,差异具有统计学意义(2=4.4 8 1,P=0.0 3 4)。1 6 8例TN B C中C P A 4表达与患者A L DH 1(2=1.5 7 5,P=0.2 0 9)无关,但与NAN
4、OG(2=4.2 0 5,P=0.0 4 0)、E-c a d h e r i n(2=1 1.7 6 4,P=0.0 0 1)、V i m e n t i n(2=4.7 9 7,P=0.0 2 9)、E G F R(2=4.0 5 7,P=0.0 4 4)差异有统计学意义。s i C P A 4抑制TN B C克隆形成,细胞成球,迁移与侵袭,抑制A L DH-1、NANOG、v i m e n t i n表达,促进E-c a d h e r i n表达。结论 C P A 4在TN B C干性进展及EMT转换过程中可能发挥一定作用,C P A 4可能是反应TN B C侵袭、转移表型的重要治疗
5、靶点。【关键词】羧肽酶A 4;三阴性乳腺癌;干性;上皮-间质转换【中图分类号】R 7 3 7.9 【文献标志码】A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.0 9.0 0 5 基金项目:湖北省教育厅指导项目(B 2 0 1 9 1 1 1)通讯作者:李文仿,硕士生导师,E-m a i l:8 5 8 6 3 1 0 4 9q q.c o m引用本文:李映东,王铁延,欧琴,等.羧肽酶A 4调控三阴性乳腺癌干性及上皮-间质转换的机制J.西部医学,2 0 2 3,3 5(9):1 2 7 0-1 2 7 5,1 2 8 1.D O I:
6、1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.0 9.0 0 5M e c h a n i s m o f c a r b o x y p e p t i d a s e A 4 r e g u l a t i o n o f s t e m a n d e p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n i n t r i p l e n e g a t i v e b r e a s t c a n c e rL I1 Y i n d o n g,WA N G T i e
7、y a n2,O U Q i n1,Z H A N G S h u m i n g1,L I W e n f a n g1(1.B r e a s t a n d T h y r o i d C e n t e r,T a i h e H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o H u b e i U n i v e r s i t y o f M e d i c i n e,S h i y a n 4 4 2 0 0 0,H u b e i,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y,T a
8、i h e H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o H u b e i U n i v e r s i t y o f M e d i c i n e,S h i y a n 4 4 2 0 0 0,H u b e i,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e x p r e s s i o n a n d c l i n i c o p a t h o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f c
9、 a r b o x y p e p t i d a s e A 4(C P A 4)i n t r i p l e n e g a t i v e b r e a s t c a n c e r(T N B C).M e t h o d s T h e e x p r e s s i o n o f C P A 4,a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e 1,NANOG,E-c a d h e r i n a n d V i m e n t i n i n T N B C t i s s u e s w e r e d e t e c t e d
10、b y i mm u n o h i s t o c h e m i s t r y.T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n C P A 4 e x p r e s s i o n a n d c l i n i c o p a t h o l o g i c a l i n d i c a t o r s i n 1 6 8 c a s e s o f T N B C w a s a n a l y z e d.C P A 4 w a s k n o c k e d o u t i n MD A-MB-2 3 1 c e l l s t o o
11、 b s e r v e t h e e f f e c t s o n c e l l p r o l i f e r a t i o n,i n v a s i o n a n d m i g r a t i o n.T h e e x p r e s s i o n o f r e l a t e d p r o t e i n s w a s d e t e c t e d b y W e s t e r n B l o t.R e s u l t s T h e e x p r e s s i o n r a t e o f C P A 4 i n T N B C t i s s u
12、 e s w a s 5 7.1 4%,s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n n o n-TN B C t i s s u e s(3 7.5%),t h e d i f f e r e n c e w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t(2=5.0 0 9,P=0.0 2 5).C P A 4 e x p r e s-s i o n i n T N B C w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t
13、h a n t h a t i n b r e a s t h y p e r p l a s i a t i s s u e s b y 2 0%,a n d t h e d i f f e r e n c e w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t(2=9.8 5 0,P=0.0 0 2).T h e e x p r e s s i o n o f C P A 4 i n 1 6 8 TN B C p a t i e n t s w a s n o t a s s o c i a t e d w i t h A L DH
14、1(20721西部医学 2 0 2 3年9月 第3 5卷第9期 M e d J W e s t C h i n a,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.9=1.5 7 5,P=0.2 0 9),b u t w i t h NANOG(2=4.2 0 5,P=0.0 4 0),E-c a d h e r i n(2=1 1.7 6 4,P=0.0 0 1),V i m e n t i n(2=4.7 9 7,P=0.0 2 9),E G F R(2=4.0 5 7,P=0.0 4 4).S i C P A 4 i n h i b i t s T N B
15、 C c l o n e f o r m a t i o n,m i g r a t i o n a n d i n v a-s i o n,i n h i b i t s t h e e x p r e s s i o n o f A L DH-1,NANOG,v i m e n t i n a n d p r o m o t e s t h e e x p r e s s i o n o f E-c a d h e r i n.C o n c l u s i o n C P A 4 m i g h t p l a y a r o l e i n t h e s t e m p r o g
16、r e s s i o n o f T N B C a n d t h e t r a n s f o r m a t i o n o f EMT,a n d C P A 4 m i g h t b e a n i m p o r-t a n t t h e r a p e u t i c t a r g e t f o r T N B C i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s p h e n o t y p e s.【K e y w o r d s】C a r b o x y p e p t i d a s e A 4;T r i p l e n
17、 e g a t i v e b r e a s t c a n c e r;S t e m;E p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n 乳腺癌被分为l u m i n a l A,l u m i n a l B,人表皮生长因子受体2(HE R-2)和三阴性乳腺癌(T r i p l e n e g a t i v e b r e a s t c a n c e r,T N B C)等不同分子亚型1。T N B C以E R、P g R、HE R 2的缺失为特征,表现出相对的侵袭性表型,治疗抵抗和预后不良特征。T N
18、 B C富含癌干细胞(C a n c e r S t e m C e l l s,C S C s)和上皮-间充质细胞转化(E p i t h e l i a l-M e s e n c h y m a l T r a n s i t i o n,EMT)特征,特征是上皮标志物的下调和出现具有间充质表型的高侵袭、迁移能力2。羧肽酶A 4(C P A 4)催化释放羧基端氨基酸,其过表达有与肝癌、肺癌的等癌症发展有关3。最近研究表明C P A 4与p 5 3表达呈负相关,抑制C P A 4可减少具有干细胞特征的乳腺癌细胞数量,可能是T N B C治疗的一个潜在靶点4。然而,很少有研究探讨C P A
19、4在T N B C患者的表达及临床病理因素关系。本研究的目的是阐明T N B C中C P A 4表达与干性及EMT的关系,为此进行免疫组化评估T N-B C中C P A 4表达与临床病理标志物,包括干性蛋白醛脱氢酶1(A L DH 1)、NANOG,EMT相关蛋白e-钙粘蛋白(E-c a d h e r i n)、V i m e n t i n、E G F R等表达关系。现报告如下。1 资料与方法1.1 一般资料 收集我院2 0 1 9年1月-2 0 2 1年1 0月手术切除经临床病理诊断确诊的T N B C早期患者1 6 8例,同期非T N B C共4 0例,同期乳腺包块切除后诊断乳腺增生组
20、织2 0例。其中年龄2 97 3岁,平均(5 2.2 84.1 2)岁,肿瘤5 0共6 1例。纳入标准:患者经穿刺病理活检确诊为乳腺癌。患者病理标本检测均显示E R、P g R及HE R-2表达阴性。男性乳腺癌除外。患者入院前未接受任何形式的手术治疗、放疗或化疗。所有患者确诊时均经肺部及颅脑C T、骨扫描、肝胆B超等排除远处转移。排除标准:合并存在其他严重器质性病变或脏器功能不足。合并存在其他恶性肿瘤。精神疾病患者,无法有效配合研究的开展。肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级情况,是否新辅助化疗等情况根据病理资料及患者病历记载资料。1.2 设备与试剂 采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶
21、连结(S t r e p t a v i d i n-p e r o s i d a s e,S P)法检 测 相 对 蛋 白 表 达。C P A 4(货 号:RMA-0 8 0 7)、E G F R抗体(货号:RMA-0 8 0 4)均购自福州迈新生物技术开发有限公司,E-c a d h e r i n(货号:a b 1 4 1 6)抗体购自A b c a m公司,A L DH 1 A 1(货号:5 4 1 3 5 S)、NANOG(货号:4 9 0 3 S)、V i m e n t i n(货号:4 6 1 7 3 S F)购 自C e l l S i g n a l公司。S P试剂盒及二
22、氨基联苯胺(D i a m i n o-b e n z i d i n e,D A B)试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。1.3 方法1.3.1 免疫组化染色方法 采集患者肿瘤组织部位标本,应用1 0%甲醛溶液进行石蜡包埋处理后连续切片。对切片标本进行脱蜡水化处理和微波修复抗原处理,参照诺丁汉联合组织学分级标准5,将T N B C分为1、2、3级6。1.3.2 免疫组化染色结果判读 石蜡切片厚4 L,切片二甲苯脱蜡,枸橼酸钠溶液抗原修复液9 8 持续1 5 m i n修复抗原,兔抗人C P A 4单克隆抗体(1 1 0 0)4 过夜,切片用P B S冲洗,与辣根过氧化酶标记的二抗孵育,D
23、 A B检测,苏木素染色,最后由两名专业病理学家进行评估。记录染色强度为阴性至强(03),阴性(0分),弱阳性(1分),中等阳性(2分),强阳性(3分)。染色阳性面积评分0分(7 6%)。染色面积评分染色强度评分为最终得分,得分4判断阳性,1 0%判断阳性8。E G F R肿瘤细胞胞质或胞膜着色即判为阳性(+),否则判为阴性(-)5。1.4 s i-C P A 4转染 设空白对照组、无效干扰组及s i-C P A 4组。设计小分子靶向C P A 4的核苷酸序列s i R NA:5 -G C AG C A C G G C AG T C T T T GAG T-3,序列由上海生工合成,无效干扰R
24、NA为不靶向作用任何mR NA的小分子核苷酸序列(s i R NA N C),序列为:5 -UU C U C C GAA C GU GU C A C GU-3。C P A 4的s i R NA按照转染L i p o f e c t i o n 2 0 0说明,转染乳腺癌细胞MD A-MB-2 3 1。1721西部医学 2 0 2 3年9月 第3 5卷第9期 M e d J W e s t C h i n a,S e p t e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.91.5 MT T细胞增殖实验 MD A-MB-2 3 1细胞在9 6孔板上,实验分为空白对照组,无效干扰组
25、及s i-C P A 4组,转染2 4 h后每孔6.01 0 3细胞在3 7,5%C O2条件下培养在1 0%胎牛血清的DMEM中。用无菌3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MT T)2 0 L(5 m g/m l;S i g m a,U S A),在3 7 下放置4 h,然后去除培养基,加入1 5 0 L的二甲亚砜(DM S O),充分混合1 0 m i n,测量4 9 0 n m处的光谱吸光度。每组在每个时间点设3个重复孔,实验独立重复3次。用4 9 0 n m处的吸光度随时间变化绘制了生长曲线。1.6 细胞克隆形成 乳腺癌细胞系MD A-MB-2 3 1培养在6孔板
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