天津地区梨轮纹病病原菌的分离与鉴定.pdf
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1、天津农业科学TianjinAgricultural Sciences植物保护天津地区梨轮纹病病原菌的分离与鉴定2023,29(9):42-46,52汪宇轩1,周涛1,周逸文1,李齐升1,王卉1,单宏英1(天津农学院园艺园林学院,天津30 0 39 2)摘要:梨是我国仅次于苹果的重要水果,随着种植面积的增大,在生产过程中梨树易遭受多种病害的威胁,其中轮纹病是严重威胁梨产业的病害之一,常造成重大经济损失。梨是天津蓟州区特色水果之一,轮纹病主要危害成熟期果实,化学防治效果不明显,且该病害病原菌种类呈多样化。为了明确致病菌种类,采用组织分离法、形态学比较分析、致病性检测和分子生物学手段对病原菌进行鉴定
2、。结果表明:于病样组织中分离得到一株真菌ZT98,在PDA培养基上呈灰色圆形菌落,菌丝有隔膜,尖端较细,致病性分析结果显示,菌株ZT98接种2 3d即出现同心浅褐色轮纹,发病后期果实呈黑褐色皱缩,表层布满一层深灰色菌丝和黑点,与田间症状基本一致;提取ZT98基因组DNA后进行ITS基因扩增并测序,在NCBI获得基因序列登录号为OR054159,ITS基因系统发育分析结果显示,ZT98与葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)聚于同一分支,同源性为10 0%。综上,本研究分离得到了一株天津地区梨轮纹病致病菌ZT98,结合形态学特征和ITS序列比对分析,明确了ZT98的分类地位,
3、为该病害的精确诊断和有效防治提供依据。关键词:梨;轮纹病;葡萄座腔菌;ITS中图分类号:S432.1Isolation and Identification of A Pathogen Causing Pear Ring Spot in TianjinWANG Yuxuan,ZHOU Tao,ZHOU Yiwen,LI Qisheng,WANG Hui,SHAN Hongying(College of Horticulture and Landscape Architecture,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300392,China)Abst
4、ract:Pear,second only to apples,is an important fruit in China.Various diseases are prone to attack pear during cultivation andproduction with the increased planting area.Ring rot,causing significant economic losses frequently,is one of the serious diseases thatendangers the pear industry.The pathog
5、ens of pear ring rot are a litle diverse according to the previous studies.Therefore,this studytried to isolate and identify the pathogens of ring rot by tissue direct isolation,morphological analysis,pathogenicity detection andmolecular determination.The results indicated that a strain ZT98 was obt
6、ained after isolation and purification of snow pear ring spotinfected samples,which showed gray round colonies on PDA medium.Mycelia of ZT98 had diaphragm with a thinner top.Pathogenic-ity detection according to Kochs rules displayed that ZT98 was a pathogen caused serious symptoms on pear fruits.Th
7、e concentricbrown rings were consistent with the symptoms in the field.The infected sites became dark brown at the later infecting stage but with-out spores were observed.Phylogenetic analysis of ZT98 was performed by extracting the genomic DNA and amplifying ITS.The ITSGenebank accession number of
8、ZT98 was 0R054159.ZT98 was clustered in the same branch as Botryosphaeria dothidea with 100%homology.In conclusion,this study determined the pathogen causing pear ring rot in Tianjin,providing a basis for accurate diagnosisand effective control of this disease.Key words:pear;pear ring rot;Botryospha
9、eria dothidea;ITS文献标识码:AD0I编码:10.39 6 9/j.issn.1006-6500.2023.09.008梨是蔷薇科梨属的一种乔木植物,有“天然矿泉水”之称。梨在我国的种植历史十分悠久,最早可追溯到春秋战国时期。我国是梨种植大国,梨的种植面积仅次于苹果,在我国占有重要的经济地位1-3,种植地区主要分布在16 个省、直辖市,包括华北、华中、东北、西北、鲁东等地区,华南和西南地区种植面积相对较少。在种植生产过程中,梨常遭受多种病害的威胁,如梨锈病、黑星病、轮纹病和黑斑病等。梨轮纹病又叫粗皮病或瘤皮病,是我国北方梨主产区的重要病害之一,该病害受湿度影响较大,在多雨年份危
10、害严重。梨轮纹病主要由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)病原菌引起,在梨的树干、果实和叶片均造成严重同心收稿日期:2 0 2 3-0 8-30基金项目:植物病虫害生物学国家重点实验室2 0 2 0 年度开放基金(SKL0F202003);天津市教育委员会自然科学项目(2 0 2 1KJ105);国家级大学生创新创业训练项目(2 0 2 0 10 0 6 10 0 9,2 0 2 110 0 6 10 41)作者简介:汪宇轩(2 0 0 1一),男,青海海东人,在读本科生,主要从事植物病害病原鉴定和防治研究。通讯作者简介:单宏英(19 8 7 一),女,内蒙古赤峰人,博士,讲师,主要从
11、事植物病毒与寄主互作的分子机制和植物病原菌鉴定研究。第9 期汪宇轩等:天津地区梨轮纹病病原菌的分离与鉴定43轮纹症状,严重时导致叶片脱落、果实腐烂或树势衰弱,造成大面积烂果和果园绝产。梨轮纹病最早在日本被发现,后续在我国东北和西南地区报道1,3。近年来梨轮纹病病害在亚洲扩展速度快,已遍布韩国等邻国梨产业园区5。化学防治梨轮纹病病害常造成严重的环境污染和农药残留,选育抗病品种已经成为优先选择,但针对梨轮纹病抗病品种和有效药剂的筛选报道较少,种质资源的收集和鉴定也需要大量的人力物力和时间。张璐等6发现,砀山酥梨和雪花梨抗轮纹病菌的能力显著优于丰水梨和南果梨,且通过药剂筛选发现咯菌腈、氟啶胺和咪鲜胺
12、对梨轮纹病菌具有明显的抑制效果。梨是天津的特色水果之一,种植面积达6 万hm,其中静海区(约2 万hm)、蓟州区(约3万hm)、北辰区、武清区和西青区共计种植约1万hm,主打优质精品梨的发展趋势进人市场。蓟州区具有悠久的梨树种植历史,种植区域覆盖11个乡镇100多个旅游村和景区。部分梨园近年发现较严重的轮纹病病害,平均发病率达30%50%,大部分果园发病率在30%。发病果实品质和产量均下降,影响树势和果园的长期发展,且化学药剂对该病害的防治效果不显著,给果农造成严重的经济损失。梨轮纹病的致病菌种类在不同梨产区呈多样化18-9,同一病原菌在不同地区导致的症状有显著差别10。因此,确定轮纹病的致病
13、菌对于该病害的防治至关重要。本研究通过对天津蓟州区下营镇梨园轮纹病致病菌的分离纯化、形态学比较、致病性检测和分子生物学鉴定等手段,明确了梨轮纹病致病菌种类和分类地位,为该病害的田间诊断和有效防治提供依据,1材料与方法1.1病害样品采集梨果实轮纹病样品采集自天津市蓟州区下营镇梨园(N4018,E117 45),采样梨园轮纹病发病程度约30%。1.2病原菌分离纯化和形态观察选取有典型轮纹病病害症状的雪梨果实,将其病健交界处组织切成若干个0.5cmx0.5cm小块后,经7 5%酒精消毒45s,无菌水润洗3次后,待组织风干水分时,置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上,培养皿封口后于2 8 培养3 5
14、d。PD A 培养基配方如下:马铃薯2 0 0 g、琼脂2 0 g、葡萄糖2 0 g、蒸馏水定容至10 0 0 mL。将生长单一无污染菌落采用菌饼打孔法进行纯化,培养过程中观察记录分离菌株的生长特征,包括病原菌的菌丝、孢子、孢子梗和孢子囊等典型形态结构。1.3病原菌的致病性检测依据柯赫氏法则(KochsRule)对分离菌株进行致病性检测。雪梨果实经1%次氯酸钠和7 5%酒精各消毒30 s,再置于无菌水中润洗3次,待表皮风干水分后,用无菌针于接种点刺伤雪梨果实表皮制造轻微伤口从而利于病原菌侵染。于PDA培养基上生长5d的分离菌株菌饼置于大小一致的雪梨果实接种点上,每个果实接种一块菌饼,无菌培养基
15、接种雪梨果实为阴性对照。接种后将梨果实置于无菌滤纸保湿的培养皿中,利用无菌膜封口利于保湿和防止杂菌污染,于2 8 培养并观察和记录发病情况。在发病梨果实组织的病健交界处再次采用1.2 中描述的方法分离纯化病原菌,通过形态学观察和分子生物学鉴定,确保与接种菌株是同一种菌!1.4病原菌的分子生物学鉴定将分离菌株于PDA培养基中培养7 d,用无菌牙签挑取收集菌丝于1.5mL无菌管中,采用Biowott真菌DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA,检测浓度后利用琼脂糖凝胶电泳验证DNA质量。通过形态学观察该致病菌属应是葡萄座腔菌属的真菌,利用真菌rDNA-ITS通用引物(ITS1F:CCGTAGGTGA
16、ACCTG;ITS4R:TCCTCCGCTTATTGATATGC),采用 Takara的PrimeSTARMaxPremix试剂盒(RO45A)对ITS基因进行PCR扩增,反应总体系50 L:PrimeSTARMax Premix 25 L、IT S1F和ITS4R引物各2.0 L、DNA模板溶液2.0 L、d d H z 0 19.0 L。反应程序为98预变性1min,98变性10 s,55退火30 s,72延伸1min;共35个循环;最后一个循环结束后7 2 延伸10 min;4条件下终止反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,委托华大基因有限公司进行序列测定。将ITS基因序列在NCB
17、I中BLAST比对同源性,筛选同源性高的序列并利用MEGA11.0中邻接法(neighnourjoining)构建系统发育树,明确致病菌株的种类和分离地位2 1。2结果与分析2.1雪梨轮纹病危害症状梨轮纹病病原菌可危害果树树干、枝条、叶片和果实,其中对于成熟期的果实危害较为严重,影响果实成熟和质量,给果农造成严重的经济损失。该病原44:菌危害初期形成浅褐色水渍斑点,逐渐扩大形成同心的浅褐色环形轮纹,环形轮纹间是健康雪梨组织颜色。果实发病处的表皮脆软,若果园湿度大,挤压易流出较为粘稠的褐色液体,并有酸臭味道。随着时间延长,发病点颜色由浅褐色逐渐变成深褐色,病果A天津农业科学持续发病10 d左右即
18、全部腐烂,病斑呈黑褐色皱缩,因失水而变成僵果,表层布满一层深灰色菌丝并且布满黑点(图1-A和图1-B)。挑取雪梨果实病斑处的菌丝和子实体进行显微镜观察发现无隔菌丝,未见孢子(图1-C)。B第2 9 卷A.早期受梨轮纹病菌侵害典型的轮纹症状;B.危害后期受梨轮纹病菌致病症状;C.雪梨轮纹病组织镜检观察菌丝体。图1梨果实轮纹病典型症状2.2雪梨轮纹病病原菌的分离纯化雪梨轮纹病的病健交界处经病原物分离后得到形态一致的菌落2 个,进一步纯化和形态学观察确认是同一种菌。菌株ZT98在PDA培养基上生长初期呈蓬松灰白色绒毛状,菌落边缘光滑且透明,菌丝无色,具有隔膜和较细的分枝,菌丝宽度约2.3 5.6m生
19、长至5 7 d即长满直径为9 cm的培养皿,且无色素沉积(图2),继续培养至14d菌落呈灰白色,且菌板背面中心处变为黑色,但未观察到孢子或产孢结构。BE00umA.分离病原菌培养1d;B.分离病原菌培养3d;C.分离病原菌培养5d;D.分离病原菌培养7 d;E.菌丝显微形态结构特征。图2 分离得到的病原菌ZT98在PDA上的培养形态2.3菌株 ZT98 的致病性检测将分离得到的菌株ZT98依据柯赫氏法则进行致病性验证,通过菌饼打孔法直接回接到健康且大小均一的雪梨果实上,同时接种PDA培养基空白菌饼作阴性对照,接种的第1天、第3天、第5天和第7 天对照均无症状(图3-A、图3-B、图3-C、图3
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