企鹅珍珠贝足丝蛋白3基因的克隆及其表达分析.pdf
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1、D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 1 1 2 0第4 2卷第4期2 0 2 3年7月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.4J u l.2 0 2 3企鹅珍珠贝足丝蛋白3基因的克隆及其表达分析杨 蕾,陈 一,张佳谊,战 欣(海南大学 海洋学院,南海海洋资源利用国家重点实验室,海南 海口5 7 0 2 2 8)摘 要:为探明企鹅珍珠贝足丝黏附的分子机理,基于企鹅珍珠贝转录组序列,应用R A C E-P C R技术获得足丝蛋白3(B P 3)基因的c D NA全长序列,通过实时荧光
2、定量P C R技术分析B P 3基因在有足丝企鹅珍珠贝各组织及有/无足丝个体足中的表达情况。结果显示,企鹅珍珠贝B P 3基因c D NA全长为6 0 1b p,开放阅读框长4 5 3b p,共编码1 5 0个氨基酸,该基因5 端非编码区为7 1b p,3 端非编码区为7 7b p。蛋白质分子质量为1 6.8 1k u,等电点为7.3 3,是一种亲水性稳定膜外蛋白,主要定位于细胞外基质。氨基酸序列比对表明,企鹅珍珠贝足丝蛋白3与厚壳贻贝同源性最高,为3 0.3 4%。实时荧光定量P C R结果显示,各组织中均有B P 3基因mR NA表达,表达量在外套膜组织中最高,与足、闭壳肌、珍珠状袋存在显
3、著差异(P0.0 5),且在有足丝企鹅珍珠贝个体足中的表达量显著高于无足丝个体足(P0.0 5)。本试验结果可为进一步探究企鹅珍珠贝足丝黏附的分子机理提供基础。关键词:企鹅珍珠贝;足丝蛋白3基因;基因克隆;基因表达模式中图分类号:Q 7 8 6文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 4-0 6 1 3-0 9收稿日期:2 0 2 1-0 7-0 5;修回日期:2 0 2 1-1 2-0 1.基金项目:国家自然科学基金资助项目(3 1 8 6 0 7 2 7).作者简介:杨蕾(1 9 9 7),女,硕士研究生;研究方向:贝类遗传育种.E-m a i l:1 6
4、 2 2 8 3 0 7 9 5q q.c o m.通信作者:战欣(1 9 8 1),女,副教授;研究方向:贝类遗传育种.E-m a i l:z h a n x i n u n i 1 6 3.c o m.企鹅珍珠贝(P t e r i ap e n g u i n)属软体动物门双壳纲珍珠贝科珍珠贝属,国外称其为翼形珍珠贝。其生长环境为热带、亚热带海域,在我国主要分布于广西、广东、海南和台湾等地1-2。企鹅珍珠贝为大型珍珠贝类,生长速度快、成活率高,且具有较高的食用价值,是我国海水珍珠养殖主要经济种类之一,同时也可以作为海洋环境监测的参考生物3-4。足丝是一种具有独特柔韧性、自愈合性和水下黏附
5、性的生物材料,企鹅珍珠贝具有发达的足丝,通过足丝附着在基质表面营固着生活,从而适应不同的环境5-6。足丝中富含各种蛋白质成分,称为黏附蛋白,目前自海洋贻贝鉴定出的足丝蛋白数量有限,分为4类7:贻贝足丝蛋白、前胶原蛋白8-1 0、足丝纤维近端基质蛋白1 1、多酚氧化酶1 2,可能还有其他蛋白参与足丝产生过程及其调控1 3-1 4。S a n-s o u c y等1 4在紫贻贝(M y t i l u sg a l l o p r o v i n c i a l i s)和加利福尼亚贻贝(M.c a l i f o r n i a n u s)足和足丝中鉴定出了潜在的与足丝形成相关的蛋白质,除上述
6、已发现的黏附蛋白外,还从足丝中发现并鉴定出足丝蛋白3(B P 3),该蛋白作为足丝本身的主要成分被检测出来。同时,沼蛤(L i m n o p e r n af o r t u n e i)中也检测出B P 3基因,且B P 3基因在足中特异表达,在足丝快速形成期高度表达,说明B P 3基因的表达与足丝的再生密切相关,在足丝形成中起关键作用1 5。目前对足丝蛋白的研究大多集中在贻贝科生物1 6-2 2,对企鹅珍珠贝足丝蛋白进行分析的报道则较少。因此,笔者以企鹅珍珠贝为研究对象,采用R A C E技术克隆B P 3基因c D NA全长序列,利用生物学信息对其进行分析,并通过实时荧光定量P C R
7、(q R T-P C R)技术分析B P 3基因在各组织中的表达特征,为后续研究企鹅珍珠贝足丝黏附的分子机理提供参考。1 材料与方法1.1 材料试验用企鹅珍珠贝采自三亚蜈支洲岛,选取1.5龄健康贝,用干净的剪刀剪取3个个体的足、外套膜、闭壳肌、鳃、珍珠状袋、唇瓣等组织,保存于R NA保存液中用于R NA提取。将剩余的贝暂养在海南海昌虾苗繁育基地(海南文昌)1 4d后,剪断企鹅珍珠贝的足丝,7 2h后,收集分泌足丝个体的足(3个)和未分泌足丝个体的足(3个),保存于R NA保存液中备用。1.2 方法1.2.1 引物设计试验所用引物见表1。表1 足丝蛋白3试验所用引物 T a b.1 P r i
8、m e r su s e d i nt h eB P 3e x p e r i m e n t s引物P r i m e r序列S e q u e n c e(5 3)用途P u r p o s eB P 3-O u t e rGA G T G T C AA T G G GAA G G3 R A C EB P 3-I n n e rT G G C T G T AA T C G T T G C T3 R A C EB P 3-G S P 1G T C A T T T T C T C C AA C AA5 R A C EB P 3-G S P 2C C T C G C C T A T G T C
9、G TA T5 R A C EB P 3-c D NA-FT G G G GAA GA C A T AAA G C全长验证B P 3-c D NA-RG C A T T G T A T T C C T A T C A全长验证B P 3-FG G T A C T G G T G G GA C T T G T G Tq R T-P C RB P 3-RA C AAA T C A C C G C A G C C T A T GAq R T-P C R-A c t i nFC G G T A C C A C C A T G T T C T C A G内参基因-A c t i nRGA C C G GA
10、 T T C A T C G T A T T C C内参基因1.2.2 B P 3基因全长克隆按照I n v i t r o g e n公司T r i z o l试剂盒说明书提取企鹅珍珠贝足总R NA,并通过P r i m e S c r i p tTM反转录P C R试剂盒将其反转录为c D NA第1条链,-2 0备用。按照3 -F u l lR A C EC o r eS e tw i t hP r i-m e S c r i p tTM逆转录酶(T a K a R a,日本)说明书的3 R A C Ec D NA模板,S MA R T e rR A C E5/3 试剂盒(T a K a
11、R a,日本)说明书的5 R A C Ec D NA模板,从企鹅珍珠贝转录组数据中找到1条注释名为B P 3的U n i g e n e序列,使用P r i m e r5.0软件设计企鹅珍珠贝B P 3基因3 R A C E和5 R A C E特异性引物。以5/3 R A C Ec D N A为模板,参照3 -F u l lR A C EC o r eS e tw i t hP r i m e S c r i p tTM逆转录酶和S MA R T e rR A C E5/3 试剂盒说明书进行R A C E-P C R扩增。以B P 3-O u t e r和B P 3-G S P 1为引物进行第
12、1轮P C R扩增。P C R反应程序为:9 43m i n;9 43 0 s,5 23 0 s,7 22m i n,5个循环;9 43 0 s,5 03 0 s,7 22m i n,5个循环;9 43 0s,4 83 0s,7 22m i n,2 0个循环;7 2 1 0m i n。以第1轮P C R产物为模板,B P 3-I n n e r和B P 3-G S P 2为引物进行第2轮巢式P C R扩增。巢式P C R反应程序为:9 43m i n;9 43 0s,5 03 0s,7 22m i n,2 0个循环;7 21 0m i n。P C R产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,将目的片段胶
13、回收,连接到p M DTM1 8-T(T a K a R a,日本)载体上,转化至大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i)D H 5(T O L O B I O,中国)中,送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序。将得到的核酸序列与B P 3U n i g e n e序列拼接,根据拼接结果设计3 和5 端引物,验证拼接序列的正确性,从而获得B P 3的c D N A全长。1.2.3 B P 3基因生物信息学分析通过O R FF i n d e r工 具(h t t p s:www.n c b i.n l m.n i h.g o v/o r f f i n d e r
14、),推导企鹅珍珠贝B P 3基因编码的氨基酸序列;采用S i g n a l P4.1S e r v e r(h t t p:www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/S i g n a l P/)和C D D工具(h t t p s:www.n c b i.n l m.n i h.g o v/c d d)分析信号肽和结构域;用P r o t P a r a m(h t t p s:w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)对氨基酸组成、分子式、等电点等理化性质进行预测和分析;利用N e t NG l y c1.0S e
15、 r v e r(h t t p:www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/N e t NG l y c/)、N e t OG l y c4.0S e r v e r(h t t p s:s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p?N e t O G l y c-4.0)和N e t P h o s3.1S e r v e r(h t t p s:s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p?
16、N e t P h o s-3.1)对蛋白的N-糖基化位点、O-糖基化位点和磷酸化位点进行预测;采用TMHMM S e r v e rv.2.0(h t t p:www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/TM-HMM/)预测蛋白跨膜区域;利用P r o t S c a l e(h t t p s:w e b.e x p a s y.o r g/p r o t s c a l e/)分 析 蛋 白 亲/疏 水性;利 用P r o t c o m p9.0(h t t p:l i n u x 1.s o f t b-e r r y.c o m/b e r r y.p
17、h t m l?g r o u p=p r o g r a m s&s u b g r o u p=p r o l o c&t o p i c=p r o t c o m p a n)对蛋白的亚细胞定位进行分 析;采 用S O P MA(h t t p s:n p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/n p s a_a u t o m a t.p l?p a g e=n p s a_s o p m a.h t m l)和C O I L SS e r v e r(h t t p s:e m b n e t.v i t a l-i t.c h/s o f t
18、 w a r e/C O I L S_f o r m.h t m l)对蛋白二级结构及卷曲螺旋结构进行分析;利用B L A S T(h t t p s:b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/B l a s t.c g i)工具和C u s t a lX软件进行氨基酸序列相似性比对分析。1.2.4 实时荧光定量P C R检测B P 3基因的表达特征提取有足丝企鹅珍珠贝足、外套膜、闭壳肌、鳃、珍珠状袋、唇瓣6个组织的R NA,使用P r i m e-S c r i p tTMR Tr e a g e n tK i tw i t hg D NAE r a s e r
19、(T a K a-R a,日本)反转录第1链c D NA,进行实时荧光定量P C R检测。反应体系采用T BG r e e nP r e m i xE xT a qTM(T a K a R a,日本)2 0L体系:T BG r e e n1 0L,上、下引物各0.8L,c D NA模板2L,加双蒸水至2 0L。以-a c t i n基因作为内参,以外套膜为对照,每组设3个平行。再分别提取有足丝企鹅珍珠贝个体足和无足丝企鹅珍珠贝足的R NA,反转416水 产 科 学第4 2卷录第1链c D NA,进行荧光定量P C R,每组设3个平行。反应程序:9 53 0s,9 55s,6 03 0s,4 0
20、个循环。采用2-Ct法计算相对表达水平,运用S P S S2 6.0软件进行试验数据单因素方差分析,并用图基多重比较对平均值进行差异显著性检验,使用E x c e l 2 0 1 6软件作图。2 结 果2.1 B P 3基因的克隆与序列分析2.1.1 B P 3基因全长c D NA的克隆使用3 R A C E、5 R A C E引物进行第2轮P C R扩增各获得了1条单一、明亮的条带(图1 a、b),长度分别约为2 4 0、1 5 0b p,将条带分别进行回收、测序,最终拼接得6 0 1b p的c D NA全长序列。再使用全长验证引物扩增目的片段,观察在5 0 0b p处有清晰、单一的目的条带
21、(图1 c),与预期结果一致。2.1.2 B P 3基因序列分析通过R A C E-P C R技术获得B P 3基因的c D NA全长序列(图2)。企鹅珍珠贝的B P 3基因c D NA全长为6 0 1b p,开放阅读框长4 5 3b p,共编码1 5 0个氨基酸,该基因5 端非编码区为7 1b p,3 端非编码区为7 7b p。在B P 3基因序列3 端非编码区含有1个P o l y(a)典型信号序列(AAT AAA)和终止子(T GA)。图1 B P 3基因克隆电泳结果F i g.1 E l e c t r o p h o r e s i s o f a m p l i f i e dB
22、P 3f r a g m e n t f r o mp e a r l o y s t e rP.p e n g u i nM 1.分子标记6 0 0b p;M 2.分子标记2 0 0 0b p;1.3 R A C E扩增产物;2.5 R A C E扩增产物;3.全长扩增产物.M 1.m a r k e r6 0 0b p;M 2.m a r k e r2 0 0 0b p;1.3 R A C Ep r o d u c c t;2.5 R A C Ep r o d u c c t;3.f u l l l e n g t hp r o d u c t.图2 B P 3基因c D NA及其编码的氨
23、基酸序列F i g.2 C o m p l e t ec D N Aa n dd e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo fB P 3g e n e f r o mp e a r l o y s t e rP.p e n g u i n方框表示起始密码子和终止密码子;表示分泌信号肽裂解位点;表示P o l y(a)信号.T h es t a r t c o d o na n ds t o pc o d o na r es h o w ni nb o x;i n d i c a t e st h ec l e a v a g es i t eo f
24、s e c r e t e ds i g n a lp e p t i d e;i n d i c a t e sP o l y(a)s i g n a l.516第4期杨 蕾等:企鹅珍珠贝足丝蛋白3基因的克隆及其表达分析2.2 B P 3基因生物信息学分析2.2.1 蛋白信号肽及结构域分析使用S i g n a l P4.1S e r v e r对足丝蛋白3氨基酸序列进行信号肽分析(图3 a),发现原始剪切位点(C-s c o r e)和综合剪切位点值(Y-s c o r e)均在L y s2 3处呈现最大值,表明足丝蛋白3含有2 2个氨基酸残基(M e t1G l y2 2)的信号肽。而C
25、 D D工具分析(图3 b)发现,在足丝蛋白3氨基酸序列中并不包含保守结构域。图3 B P 3基因所编码蛋白质的信号肽剪切位点(a)、保守结构域(b)F i g.3 T h e s i g n a l p e p t i d e s p l i c i n gs i t e(a)a n dt h ec o n s e r v e dd o m a i n(b)o fB P 3f r o mp e a r l o y s t e rP.p e n g u i n2.2.2 氨基酸理化性质预测分析P r o t P a r a m氨基 酸 理 化 性 质 预 测 结 果 表 明,企鹅珍珠贝足丝蛋白
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