枇杷外泌体及细胞液基于体外水平的护肤功效研究.pdf
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1、热带作物学报 2023,44(7):14881496 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-07-12;修回日期 2022-09-14 基金项目 国家自然科学基金项目(No.31501735);厦门市产学研项目(No.2022350204004647)。作者简介 李惠华(1980),女,博士,研究员,研究方向:植物分子生物学及植物细胞悬浮培养。*通信作者(Corresponding author):徐夙侠(XU Suxia),E-mail:。枇杷外泌体及细胞液基于体外水平的护肤功效研究 李惠华,吴美芳,王 伟,徐夙侠*福建省亚热带植物研究所/福
2、建省亚热带植物生理生化重点实验室,福建厦门 361006 摘 要:探索枇杷(Eriobotrya japonica L.)外泌体及细胞液对体外人皮肤细胞的生物活性,为其在护肤品上的开发提供科学依据。采用超高速离心法和机械破碎法分别获得枇杷外泌体和细胞液,以 CCK8 法检测不同浓度枇杷叶来源外泌体、枇杷细胞悬浮培养来源的外泌体及其细胞液对人皮肤成纤维细胞(HSF)存活率的影响;对 HSF 细胞采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理进行炎症造模,选取显著促进细胞存活率的浓度,后续开展添加外泌体或细胞液处理,进行细胞凋亡及迁移能力检测。对黑色素瘤细胞(A375)开展外泌体或
3、细胞液处理,进行黑色素含量及酪氨酸酶活性检测。结果表明:每克枇杷叶含 8.54109个外泌体颗粒,粒径 86.78 nm;每毫升(约 1 g)枇杷悬浮细胞上清液中含 8.67108个外泌体颗粒,粒径 80.39 nm。浓度为 20 g/mL 时,枇杷叶外泌体、枇杷悬浮细胞外泌体、枇杷悬浮细胞液均显著提高体外 HSF 细胞存活率(P0.05)。与阳性对照(LPS 处理)相比,枇杷叶外泌体浓度为 20 g/mL,枇杷悬浮细胞外泌体浓度为 20 g/mL 和枇杷悬浮细胞液浓度为 10 g/mL 时,均极显著降低 LPS 处理引起的细胞凋亡(P0.01),均显著促进细胞迁移(P0.05)。浓度为 5
4、g/mL 的枇杷悬浮细胞外泌体和枇杷悬浮细胞液均可显著降低体外 A375 细胞黑色素含量,枇杷细胞液还显著降低酪氨酸酶活性(P0.05)。关键词:枇杷;外泌体;悬浮细胞;细胞液;护肤功效 中图分类号:TS209 文献标识码:A Loquat Exosomes and Cytosol for Skin Care Efficacy in vitro LI Huihua,WU Meifang,WANG Wei,XU Suxia*Fujian Institute of Subtropical Botany/Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemi
5、stry for Subtropical Plant,Xiamen,Fu-jian 361006,China Abstract:The biological activity of loquat exosomes and cytosol on human skin cells in vitro was explored to provide a scientific basis for the development of skin care products.The loquat exosomes and cytosol were obtained by ul-tra-high-speed
6、centrifugation and mechanical disruption,respectively.Firstly,the effect of different concentrations of loquat leaf-derived exosomes(loquat leaf-exo),loquat cell suspension culture-derived exosomes(loquat suspension-exo)and loquat cell suspension culture-derived cytosol(loquat suspension-cytosol)on
7、cell viability of human skin fibroblasts(HSF)was detected by the CCK8 method.And then,HSF cells were treated with LPS(lipopolysaccharide)for inflam-mation modeling,and the concentration that significantly promoted the cell survival rate was selected,followed by adding exosomes or cytosolic treatment
8、 to detect cell apoptosis and migration ability.Secondly,the melanoma cells(A375)were subsequently treated with exosomes or cytosol,and the melanin content and tyrosinase activity were de-tected.The concentration of exosomes per gram of loquat leaves was 8.54109 particles,and the particle size was 8
9、6.78 nm;each milliliter(approximately equal to 1 g)of loquat suspension cells contained exosomes with a concentra-tion of 8.67108 particles,with a particle size of 80.39 nm.At the concentration level of 20 g/mL,loquat leaf-exo,lo-quat suspension-exo,and loquat suspension-cytosol all significantly in
10、creased the survival rate of HSF cells in vitro(P0.05).Compared with the positive control(LPS treatment group),loquat leaf-exo at 20 g/mL,loquat suspen-sion-exo at 20 g/mL and loquat suspension-cytosol at 10 g/mL significantly reduced the apoptosis induced by LPS 第 7 期 李惠华等:枇杷外泌体及细胞液基于体外水平的护肤功效研究 14
11、89 treatment(P0.01),both significantly promoted cell migration(P0.05).5 g/mL loquat suspension-exo and loquat suspension-cytosol could significantly reduce the melanin content of A375 cells in vitro,and loquat suspension-cytosol could also significantly reduce the tyrosinase activity(P0.05).Keywords
12、:Eriobotrya japonica;exosomes;suspension cells;cell fluid;skin care DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.07.020 枇杷(Eriobotrya japonica L.)为蔷薇科枇杷属植物,其叶及花有清肺止咳、和胃降逆、止渴之功效1,是传统药食同源植物。枇杷叶(果)提取物、叶原生质体已收录于 已使用化妆品原料目录(2021 年版)。由于枇杷果期(保存期)短,分布地域狭窄,导致果实应用基本停留在鲜食和粗加工产品上,枇杷叶或花则在止咳清热的中药组方中长期无新的突破,大大降低了枇杷的高值利用。研究表明
13、,枇杷的应用还可以拓展到很多领域,如治疗寻常型痤疮2-3,卷烟加香4,挥发性成分可以直接吸入肺部给药5-6等。目前,有必要结合新热点和新技术对枇杷的应用进行新的拓展。外泌体(exosome)首次发现于 1983 年,是一种细胞内膜衍生的纳米级囊泡,存在于动物、植物以及微生物中7。它具有磷脂双分子层结构而高度稳定,可保护内含物(一般为复杂核酸和特异蛋白)免受降解并运送至受体细胞8-9。其自身也具有某些生物活性,如参与基因转录调控10-11,通过细胞介质传递影响其他细胞功能12,可作为癌症、免疫性疾病等早期诊断的生物学标志13。此外,外泌体在跨界细胞或物种间有广泛的应用前景14-15,如间充质干细
14、胞外泌体可促进烫伤后皮肤的恢复及再生16;人血小板外泌体可改善面部光损伤和皮肤老化的各种临床指标,并具安全性和良好耐受性17。生姜外泌体可重塑肠道菌群、缓解结肠炎18;景天外泌体可抗肺纤维化19;牛奶、生姜外泌体可作为天然纳米载体以提高药物利用率20-21;外泌体可作为基因或细胞治疗中理想的药物或传送递质22。外泌体已成为生物学、医药学等研究的热点。采用枇杷细胞悬浮培养技术生产三萜类次生物质,是不同于现有从枇杷叶提取的另一有效途径22-24。项目组前期研究表明,通过枇杷细胞悬浮培养,细胞内能够产生几倍至十几倍高于枇杷原植株的五环三萜类化合物,原废弃的细胞培养液中易分离制备丰富的外泌体。目前缺乏
15、枇杷外泌体和细胞液功能的相关研究报道。本研究基于已建立的优良的枇杷悬浮细胞系,分离外泌体及其细胞液,以鲜枇杷叶分离外泌体,探索这 3 种材料对体外人皮肤成纤维细胞(HSF)的功效以及对黑色素含量和酪氨酸酶活性的影响,以期为枇杷细胞今后在护肤品领域的开发提供科学依据。1 材料与方法 1.1 材料 已有悬浮培养的枇杷细胞系(早钟 6 号),诱导自幼果,由福建省亚热带植物研究所诱导、优化并长期继代培养,具体技术参见文献25-26。液体培养基为 MS 培养液附加 NAA 0.5 mg/L,茉莉酸甲酯(MeJ)375 mg/L,蔗糖 2%,pH 5.8,培养条件为:接种量 8 g/100 mL,温度 2
16、5,白炽灯 400 Lux,转速 130 r/min,于 250 mL 三角瓶(装液量 130 mL)中。接种后 10 d 收获。选取早钟 6 号枇杷顶端第 2 对嫩叶,2021 年9 月采收于福建省亚热带植物研究所药用植物资源圃。人皮肤成纤维细胞(HSF)、人黑色素瘤(A375)细胞购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。1.2 方法 1.2.1 外泌体分离及鉴定 采用超高速离心法分离 外 泌 体。对 数 生 长 期 的 枇 杷 悬 浮 细 胞 液250 mL,于 4,5000 r/min,离心 5 min,收集上清 200 mL(约为 200 g);4,150 000 r/min,离心 1
17、20 min,弃上清,预冷 PBS 300 L 重悬沉淀,0.45 m 滤膜除菌,80 备用。取枇杷叶片65 g,破壁机研磨获取汁液,4,5000 r/min,离心 20 min,收集上清;4,10 000 r/min,离心 40 min,收集上清;4,150 000 r/min,离心120 min,弃上清,预冷 PBS 300 L 重悬沉淀,0.45 m 滤膜除菌,80 备用。利用透射电子显微镜 Hitachi HT-7700观察外泌体形态;采用粒径分析仪 NanoFCM N30E 检测外泌体的粒径和浓度信息;利用多功能酶标仪Thermo Varioskan LUX 采用 BCA 法测定蛋白
18、浓度,具体步骤如下:(1)在 37 中速融外泌体,1490 热带作物学报 第 44 卷 并迅速加入 5RIPA 裂解液;(2)混匀后在冰上裂解 30 min,期间混匀;(3)配制 BCA 法测蛋白浓度的标准样品,并取 5 L 样品加至 BCA 混合液中,混匀;(4)37 孵育 30 min,酶标仪上,在 562 nm 处测吸光值并记录;(5)根据标准曲线算出待测样品的蛋白浓度。1.2.2 枇杷悬浮细胞液的分离鉴定 取 1 g 对数生长期的枇杷悬浮细胞在超净台中研磨破碎,加入 1 mL PBS 重悬得到细胞液,4,5000 r/min,离心 5 min,收集上清获得枇杷悬浮细胞液,0.45 m
19、过滤除菌,采用 BCA 法测蛋白浓度,具体方法同 1.2.1,于80 保存,备用。1.2.3 细胞培养 人皮肤成纤维细胞(HSF)、人黑色素瘤(A375)在含有 1%双抗、10%胎牛血清的完全培养液(HSF 使用 1640 培养基,A375 使用 DMEM 培养基),37、5%CO2保持饱和湿度培养,细胞密度约 80%90%时进行常规传代。1.2.4 CCK8 法检测细胞活力 HSF 细胞按照5000 个/孔铺于 96 孔板,待细胞贴壁后用10 g/mL 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理HSF 细胞 20 h 进行炎症造模,添加含或不含外泌体或细胞液的完全培养基处理细
20、胞 48 h。模型细胞作阳性对照,正常未处理细胞为阴性对照,设置 6 个生物学重复。处理 48 h 后,加入 CCK8 试剂进行细胞活力检测,2 h 内读取 OD450值。HSF细胞按照 3105个/孔铺板至 6 cm 板,待细胞贴壁后使用。1.2.5 流式双染检测细胞凋亡 采用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的 E606336-0020 Annexin V 凋亡检测试剂盒,FITC/PI 双染法,胰酶消化细胞,1200 r/min 离心 5 min 收集细胞,PBS洗涤 2 次;195 L 1Binding buffer 悬浮细胞,加入 5 L Annexin V-FITC,4 避光孵育
21、 10 15 min;加入 200 L 1Binding buffer 洗涤细胞、1200 r/min 离心 5 min,弃上清;190 L 1Binding buffer 悬浮细胞,加 10 L PI 混匀后上机检测。设置 3 次生物学重复。1.2.6 Transwell 法检测细胞迁移能力 (1)取消化 HSF 细胞,无血清培养基洗 3 次,计数,配成浓度为 5105个/mL 的细胞悬液;上室每孔加入 100 L 细胞悬液。(2)下室中加入 500 L 含10%血清及工作浓度为 10 g/mL的 LPS完全培养基。(3)37 培养箱中,培养 20 h 后,去除下室培养基,添加含 5 g/m
22、L 外泌体进行处理,48 h后,检测穿过的细胞数。取上室,以棉签拭去小室滤膜上的细胞。用 PBS 洗后将小室置于 4%多聚甲醇固定 20 min,弃固定液,用 1%结晶紫乙醇溶液孵育 30 min 进行染色,用 1PBS 洗后倒置于普通显微镜下随机拍照。设置 3 次生物学重复。1.2.7 黑色素含量检测 将人黑色素瘤(A375)细胞按照 2107个/孔铺板至 15 cm 板,待细胞贴壁后添加含/不含外泌体或细胞液的完全培养基处理细胞 72 h。将所有样本蛋白浓度调整为5.77 g/L,取 100 L 用于测定 OD470。设 3 次生物学重复。1.2.8 酪氨酸酶活性检测 在总体积 3.0 m
23、L 的酶活反应体系中,加入 200 L 含 577 g 蛋白样本和 0.5 mmol/L 左旋多巴底物溶液 2.8 mL,充分混匀,37 水浴保温 10 min 后,于波长 475 nm处测得样品吸光度值(A)。设 3 次生物学重复。相对酪氨酸酶活性=加药处理组 A475/空白对照组A475。1.3 数据处理 采用 SPSS 软件进行数据统计与分析,利用Duncans 法进行多重比较。2 结果与分析 2.1 外泌体形态及大小 由鲜枇杷嫩叶分离的外泌体(E-leaf-exo)和枇杷悬浮细胞培养液上清分离获得的外泌体,即枇杷悬浮细胞外泌体(E-suspension-exo)具体形态见图 1,从图
24、1 可看出二者外部形态类似,均呈现典型的茶托状外泌体。利用粒径分析仪检测外泌体的粒径和颗粒数(图 2),结合方法 1.2.1中起始样本量,枇杷叶外泌体和枇杷悬浮细胞外 A:枇杷悬浮细胞外泌体;B:枇杷叶外泌体。A:E-suspension-exo;B:E-leaf-exo.图 1 枇杷悬浮细胞外泌体和枇杷叶外泌体 透射电子显微镜图 Fig.1 Transmission electron microscopy images of loquat suspension cell and loquat leaf exosomes exosomes 第 7 期 李惠华等:枇杷外泌体及细胞液基于体外水平的
25、护肤功效研究 1491 A:枇杷悬浮细胞外泌体;B:枇杷叶外泌体。A:E-suspension-exo;B:E-leaf-exo.图 2 枇杷悬浮细胞外泌体和枇杷叶外泌体平均粒径 Fig.2 Average particle size of loquat suspension cell ex-osomes and loquat leaf exosomes 泌体粒径分别为 86.78、80.39 nm;每克枇杷叶含8.54109个外泌体颗粒;每毫升(约 1 g)枇杷悬浮细胞上清中含 8.67108个外泌体颗粒。利用该方法获得的枇杷叶外泌体平均粒径大于枇杷悬浮细胞外泌体平均粒径。每克枇杷叶中外泌体
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