马氏珠母贝CD-MPR基因序列特征及其在耐低温品系的选择分析.pdf
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1、54卷南 方 农 业 学 报 1224马氏珠母贝CD-MPR基因序列特征及其在耐低温品系的选择分析韩书雅1,钟如卓1,伍灵君1,宋欣霖1,赖卓欣1,2,郑哲1,2,王庆恒1,2*(1广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;2广东省珍珠科技创新中心/广东省海水养殖生物育种工程实验室/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088)摘要:【目的】明确马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CD-MPR)基因(PmCD-MPR)多态性与其低温耐受能力的相关性,为马氏珠母贝耐低温品系的选育提供理论依据。【方法】采用R
2、ACE克隆PmCD-MPR基因序列全长,并运用实时荧光定量PCR检测PmCD-MPR基因在马氏珠母贝各组织及低温胁迫下的表达模式;基于马氏珠母贝耐低温选育系(R群体)和北部湾野生群体(W群体)的全基因组重测序数据筛选出PmCD-MPR基因外显子区的SNP位点,并通过遗传多态性分析、单倍型分析及频率计算获取与马氏珠母贝低温胁迫过程相关的SNP位点。【结果】PmCD-MPR基因序列全长902 bp,其开放阅读框(ORF)为792 bp,共编码263个氨基酸残基;PmCD-MPR基因编码蛋白分子量为30.22 kD,理论等电点(pI)为5.79,属于亲水性蛋白,在第18263位氨基酸处含有1个典型的
3、甘露糖-6-磷酸受体(Man-6-P_recep)结构域。CD-MPR氨基酸序列在N端的相似性较低,在C端的相似性较高;基于CD-MPR氨基酸相似性构建的系统发育进化树显示,马氏珠母贝与长牡蛎、加利福尼亚海兔等软体动物聚为一支,与经典的动物学分类相吻合。PmCD-MPR基因在马氏珠母贝肝胰腺的相对表达量最高,显著高于在性腺、闭壳肌和外套膜中的相对表达量(P0.05,下同);低温胁迫组马氏珠母贝鳃组织中的PmCD-MPR基因相对表达量随着胁迫时间的延长整体上呈先上升后下降的变化趋势。从PmCD-MPR基因外显子区筛选获得34个SNPs位点,且这34个SNPs位点构成5个单倍块和15种单倍型,其中
4、GCC、TG、CCCTCT等3种单倍型在R群体中的分布频率显著高于W群体,即与马氏珠母贝耐低温性状显著相关。【结论】PmCD-MPR基因参与马氏珠母贝的低温响应过程,与耐低温性状显著相关的基因型及单倍型可作为马氏珠母贝耐低温品系辅助育种的候选分子标记。关键词:马氏珠母贝;PmCD-MPR基因;低温耐受;SNP位点;选择分析中图分类号:S968.316.1文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)04-1224-11收稿日期:2022-07-06基金项目:广东省自然科学基金项目(2020A151501691);广东省现代农业产业技术体系(贝藻类产业创新团队)建设专项(2020KJ14
5、6);广东省普通高校重点领域专项(2020ZDZX1045)通讯作者:王庆恒(1977-),https:/orcid.org/0000-0001-9148-6613,教授,主要从事海洋无脊椎动物增养殖与海水珍珠培育研究工作,E-mail:第一作者:韩书雅(1997-),https:/orcid.org/0000-0002-0668-4058,研究方向为珍珠培育与加工,E-mail:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(4):1224-1234ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn
6、.2095-1191.2023.04.027Sequence characteristics of CD-MPR gene in Pinctada fucatamartensii and its selection analysis in low-temperatureresistant strainsHAN Shu-ya1,ZHONG Ru-zhuo1,WU Ling-jun1,SONG Xin-lin1,LAI Zhuo-xin1,2,ZHENG Zhe1,2,WANG Qing-heng1,2*(1Fisheries College,Guangdong Ocean University,
7、Zhanjiang,Guangdong 524088,China;2Guangdong Science andInnovation Center for Pearl Culture/Guangdong Provincial Engineering Laboratory for Mariculture Organism Breeding/Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology forAquatic EconomicAnimals,Zhanjiang,Guangdong 524088,China)Abs
8、tract:【Objective】To clarify the correlation between the polymorphism of cation-dependent mannose-6-phos-phate receptor(CD-MPR)gene(PmCD-MPR)and the low temperature tolerance of Pinctada fucata martensii,and toprovide theoretical basis for the breeding of low temperature resistant strains of P.fucata
9、 martensii.【Method】The full-4期12250引言【研究意义】马氏珠母贝(Pinctada fucata mar-tensii)是重要的海水养殖贝类及生产珍珠的主要母贝,属于低等无脊椎变温动物,自身调节体温的能力较弱,其体温一般与所处环境温度相同(Kim et al.,2009;许友卿等,2010)。马氏珠母贝的最适生长温度为2328,对低温的耐受能力较弱,水温降至68 超过21 h即导致大批量死亡(Deng et al.,2009)。目前,马氏珠母贝在我国已广泛养殖,主要分布在广西、广东和台湾海峡南部的沿海一带(邹杰等,2021),而耐低温品系的发现为马氏珠母贝在我国
10、其他地方开展人工养殖提供了可能性。因此,筛选出与耐低温性状显著相关的基因型及其单倍型,对揭示马氏珠母贝低温适应过程中的作用机制及其生物学功能具有重要意义,同时可作为选择育种的候选分子标记以加速马氏珠母贝抗寒性的遗传改良。【前人研究进展】凝集素(Lectin)作为一种糖结合蛋白,普遍存在于动植物体内,具有与细胞膜表面糖基特异性结合的特点,可作为免疫因子协助机体抵御病害(陈政强等,2007),已发现的动物凝集素主要有C型、P型、L型、M型和S型等(张可诒,2018)。阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体(Cation-dependentmannose-6-phosphate receptor,CD-M
11、PR)是P型凝集素家族的成员之一(Bhamidimarri et al.,2018),能与携带有6-磷酸甘露糖残基(M6P)的蛋白特异性结合,促使反面高尔基网合成的溶酶体酶进入溶酶体,即在溶酶体的形成过程中发挥关键作用(张可诒,2018)。已有研究表明,低温能增强溶酶体膜的通透性(Rauen et al.,2006),而有助于CD-MPR参与携带有M6P信号的溶酶体运输至溶酶体内。Wang等(2018)研究表明,溶酶体介导的适度自噬和免疫增强有助于提高马氏珠母贝在低温环境下的存活率。尤扬和张晓云(2021)对低温胁迫下桂花万点金(Os-manthus fragrans Wandian Jin)
12、叶肉细胞溶酶体超微结构变化进行观察,结果显示低温胁迫下溶酶体数量增加,推测溶酶体作为细胞内的消化场所也可为处于低温胁迫下的细胞提供营养物质,降低机体抵御低温造成的损伤。在水产动物中,CD-MPR基因的研究主要涉及斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育过程中的表达模式及其在日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)抗菌免疫中的作用(Nolan et al.,2006;Zhang et al.,2018),而有关CD-MPR在马氏珠母贝中的作用机制尚未明确。【本研究切入点】自2014年以来,本课题组通过组学分析深入挖掘出一些与耐低温相关的候选基因(Wang et al.,2018;
13、赖卓欣,2020;Lai et al.,2021),但这些基因的序列结构特征length sequence of PmCD-MPR gene was cloned by rapid-amplification of cDNA ends(RACE),and real-time fluores-cence quantitative PCR was used to detect the expression pattern of PmCD-MPR gene in various tissues of P.fucatamartensii and under low temperature stress
14、;based on the whole genome resequencing data of P.fucata martensii lowtemperature resistant line(R group)and Beibu Gulf wild population(W group),we screened for the single nucleotidepolymorphism(SNP)loci in exon regions of the PmCD-MPR gene,and obtained the SNP loci related to the low tempera-ture s
15、tress process of P.fucata martensii through the analysis of genetic polymorphisms,haplotypes,and the frequencycalculations.【Result】The PmCD-MPR gene sequence was 902 bp in length,with an open reading frame(ORF)of 792 bp,encoding a total of 263 amino acid residues;the molecular weight of the protein
16、encoded by the PmCD-MPR gene was30.22 kD,and the theoretical isoelectric point(pI)was 5.79,which belonged to the hydrophilic proteins,and it con-tained a typical mannose-6-phosphate receptor(Man-6-P_recep)structural domain at amino acids 18-263.CD-MPR aminoacid sequences were less similar at the N-t
17、erminal end and more similar at the C-terminal end;the phylogenetic tree con-structed on the basis of CD-MPR amino acid similarity showed that P.fucata martensii was clustered with mollusks suchas Crassostrea gigas and Aplysia californica,which was in line with the classical zoogeographic classifica
18、tion.The rela-tive expression of PmCD-MPR gene was the highest in the hepatopancreas and significantly higher than that in thegonads,adductor muscle and mantle(P0.05,the same below);the relative expression of PmCD-MPR gene in the gilltissues of P.fucata martensii in the low temperature stress group
19、showed a tendency to increase first and then decreasewith the prolongation of the stress time.A total of 34 SNPs were screened from the exon region of PmCD-MPR gene,andthese 34 SNPs constituted 5 haplotype blocks and 15 haplotypes.Among them,the distribution frequency of GCC,TGand CCCTCT haplotypes
20、in R population was significantly higher than that in W population,which was significantlycorrelated with the low temperature tolerance of P.fucata martensii.【Conclusion】The PmCD-MPR gene is involved in thelow temperature response process of P.fucata martensii,and the genotypes and haplotypes that a
21、re significantly associatedwith low temperature tolerance traits can be used as candidate molecular markers for assisted breeding of low temperaturetolerant lines of P.fucata martensii.Key words:Pinctada fucata martensii;PmCD-MPR gene;low temperature tolerance;SNPlocus;selection analysisFoundation i
22、tems:Guangdong Natural Science Foundation(2020A151501691);Guangdong Modern AgriculturalIndustrial Technology System(Shellfish Industry Innovation Team)Construction Project(2020KJ146);Special Projecton KeyAreas of Guangdong Colleges and Universities(2020ZDZX1045)韩书雅等:马氏珠母贝CD-MPR基因序列特征及其在耐低温品系的选择分析54卷
23、南 方 农 业 学 报 1226及其与表型性状的关联分析鲜见报道。【拟解决的关键问题】克隆马氏珠母贝CD-MPR基因(PmCD-MPR9)序列全长及分析低温胁迫下的时序表达模式,基于马氏珠母贝耐低温选育系(Low tempera-ture resistant line,R)和北部湾野生群体(Beibu Gulfwild population,W)的全基因组重测序数据筛选出PmCD-MPR基因外显子区的SNP位点,并通过遗传多态性分析、单倍型分析及频率计算获取与马氏珠母贝温度胁迫过程相关的SNP位点,旨在明确PmCD-MPR基因多态性与其低温耐受能力的相关性,为马氏珠母贝耐低温品系的培育提供理论
24、依据。1材料与方法1.1试验材料供试马氏珠母贝取自广东省雷州市后洪村海区,选取活力较强、鳞片旺盛、规格一致的2龄成贝,贝壳长69.233.80 mm。将马氏珠母贝表面冲洗干净,运回实验室22 暂养48 h后用于试验。随机采集8只马氏珠母贝的闭壳肌(A)、性腺(GO)、鳃(GI)、外套膜(M)和肝胰腺(HE)等组织样品,液氮速冻后置于-80 冰箱保存备用。另取300只马氏珠母贝随机分成3组,其中,2个低温胁迫组水温分别设为12和17,对照组水温为22。各处理组的马氏珠母贝分别置于300 L养殖桶中养殖,每天投喂等量的单胞藻并微充气,日换水量为50%。分别在低温胁迫后第6、24、72和120 h等
25、4个时间点每处理随机取8只马氏珠母贝,剪取其鳃组织液氮速冻后-80 保存备用。1.2PmCD-MPR基因克隆及组织表达分析利用Primer Premier 5.0设计扩增引物(表1),总RNA提取、cDNA第一链合成及RACE克隆参考刘雅(2018)的方法。实时荧光定量PCR检测以-actin为内参基因,采用2-Ct法换算PmCD-MPR基因在马氏珠母贝各组织及3个温度4个时间点的相对表达量,以SPSS 26.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。1.3PmCD-MPR蛋白生物信息学分析采 用 DNAMAN、ORF Finder、Pfam、ExPASy-ProtParam、Sig
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