灵芝提取物通过抑制miR-143-3p保护Aβ25-35处理PC12细胞损伤的机制研究.pdf
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1、论著202J Clin Neurol,June 2023,Vol.36,No.3灵芝提取物通过抑制miR-143-3p保护A25-3s处理PC12细胞损伤的机制研究尹志鹏,吴玲玲,陈光东【摘要】目的探究灵芝提取物通过抑制miR-143-3p对-淀粉样蛋白(A25-35)诱导的PC12细胞损伤的影响。方法使使用2 0 mol/L的A25-3s处理PC12细胞用于建立体外Alzheimers病模型,细胞分为空白组(未经A25-3s处理细胞)、模型组(经过A25-3s处理细胞2 4h)、低剂量组(2.5mg/L灵芝提取物和A25-35处理细胞2 4h)、中剂量组(5.0 mg/L灵芝提取物和A25-
2、3s处理细胞2 4h)、高剂量组(10 mg/L灵芝提取物和A25-35处理细胞2 4h)、mi R-NC+高剂量组(转染miR-NC后,使用10 mg/L灵芝提取物和A25-35处理细胞2 4h)、mi R-143-3p+高剂量组(转染miR-143-3p后,使用10 mg/L灵芝提取物和A25-3s处理细胞2 4h)。用噻唑蓝检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;WesternBlotting法检测剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、Bc l-2 相关X蛋白(Bax蛋白)的表达;ELISA检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、
3、过氧化氢酶(CAT)活性、A、T NF-、IL-6 水平;实时定量RT-PCR(q RT-PCR)检测miR-143-3p表达水平。结果与空白组相比,模型组细胞活性、SOD活性、CAT活性显著降低,调亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达、Bax蛋白表达、MDA含量、A、T NF-、IL-6 水平以及miR-143-3p表达水平显著增加(均P0.05)。与模型组相比,低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞活性、SOD活性、CAT活性显著增加,调亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达、Bax蛋白表达、MDA含量、A、T NF-、IL-6 水平以及miR-143-3p表达水平显著降低
4、(均P0.05)。与miR-NC+高剂量组相比,miR-143-3p+高剂量组miR-143-3p表达水平、Cleaved-caspase-3、Ba x 蛋白表达、调亡率、MDA含量、A、T NF-、IL-6 水平显著增加,细胞活性、SOD活性、CAT活性显著降低(均P0.05)。结论灵芝提取物可能通过下调miR-143-3p减弱A25-35诱导的神经细胞凋亡、氧化应激和炎症反应。【关键词】灵芝提取物;miR-143-3p;A l z h e i m e r s 病;神经细胞【中图分类号】R749.16【文献标识码】A【文章编号】10 0 4-16 48(2 0 2 3)0 3-0 2 0 2
5、-0 6Mechanism of Ganoderma lucidum extract protecting A25-35 from PC12 cell injury by inhibiting miR-143-3pYIN Zhi-peng,WU Ling-ling,CHEN Guang-dong.Department of Psychiatry,Wenzhou Seventh People s Hospital,Wenzhou 325000,ChinaAbstract:Objective To explore the effect of Ganoderma lucidum extract on
6、 PC12 cell damage induced by-amyloid protein(A25-35)by inhibiting miR-143-3p.Methods PC12 cells were treated with 20 mol/L AB25-3s toestablish an in vitro Alzheimers disease model.The cells were divided into blank group(cells not treated withA25-35),model group(cells treated with A25-35 for 24 h),Lo
7、w-dose group(cells were treated with 2.5 mg/LGanoderma lucidum extract and A25-3s for 24 h),medium-dose group(cells were treated with 5.0 mg/L Ganodermalucidum extract and A25-3 for 24 h),high-dose group(cells were treated with 10 mg/L Ganoderma lucidum extractand A25-3s for 24 h),miR-NC+high-dose g
8、roup(after transfection of miR-NC,cells were treated with 10 mg/LGanoderma lucidum extract and A25-35 for 24 h),miR-143-3p+high-dose group(after transfection of miR-143-3p,cells were treated with 10 mg/L Ganoderma lucidum extract and A253s for 24 h).Cell proliferation activity wasdetected by thiazol
9、yl blue;cell apoptosis was detected by flow cytometry;Western blotting was used to detect theexpression of cleaved cysteine-containing aspartate protease 3(Cleaved-caspase-3),Bcl-2-related X protein(Baxprotein);ELISA was used to detect malondialdehyde(M D A)c o n t e n t,s u p e r o x i d e d i s mu
10、 t a s e (SO D)a c t i v i t y,catalase(CAT)activity,A,TNF-,IL-6 levels;quantitative real-time RT-PCR(qRT-PCR)was used to detectmiR-143-3p expression levels.ResultsCompared with the blank group,the cell activity,SOD activity and CATactivity in the model group were significantly decreased,and the apo
11、ptosis rate,Cleaved-caspase-3 protein,Bax基金项目:温州市科技局课题(Y20210507)作者单位:32 50 0 0 温州市第七人民医院精神科203临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第3期protein,MDA content,A,TNF-,IL-6 levels,and miR-143-3p expression level were significantly increased(allP0.05).Compared with the model group,the cell activity,SOD activity,and CAT ac
12、tivity in the low-dose group,middle-dose group,and high-dose group were significantly increased,apoptosis rate,Cleaved-caspase-3 proteinexpression,Bax protein expression,MDA content,A,TNF-,IL-6 levels,and miR-143-3p expression levels weresignificantly decreased(all P0.05).Compared with miR-NC+high-d
13、ose group,the expression level of miR-143-3p,Cleaved caspase-3,Bax protein expression,apoptosis rate,MDA content,A,TNF-,and IL-6 levels in themiR-143-3p+high-dose group were significantly increased,Cell activity,SOD activity and CAT activity weresignificantly decreased(all P0.05).Conclusion Ganoderm
14、a lucidum extract may attenuate neuronal apoptosis,oxidative stress and inflammation induced by A25-3s by down-regulating miR-143-3p.Key words:Ganoderma lucidum extract;miR-143-3p;Alzheimers disease;nerve cellsAlzheimers病(AD)又被称为“老年痴呆”,是一种不可逆的神经系统退行性疾病,随着老龄化社会的到来成为全球范围内日益严重的健康问题,对人们生活社交、工作等带来严重不利的影响
15、。AD典型病理因素有-淀粉样蛋白(A)斑块沉积、神经元纤维缠结,经过A、过度磷酸化tau作用神经突触,可使神经元功能丧失或死亡2 。灵芝药用价值历史悠久,具有补气安神、止咳平喘的功效,常用于治疗心神不宁、失眠心悸、咳嗽痰多等疾病,药理活性效果也比较明显3。灵芝提取物对帕金森病有治疗作用,能抑制1-甲基4-苯基-吡啶离子诱导的小鼠神经瘤细胞自噬4。还有研究5 显示,灵芝醇提取物能改善AD模型大鼠/小鼠的学习和记忆功能,抑制神经元细胞凋亡。关于灵芝提取物对AD细胞模型的研究相对较少。研究6 显示,在AD细胞模型中miR-143-3p表达上调,抑制miR-143-3p可减弱A142诱导的人神经母细胞
16、瘤细胞凋亡。然而,灵芝提取物能否通过调控miR-143-3p延缓AD神经细胞损伤尚不清楚。本研究使用A25-3s诱导神经细胞PC12建立AD细胞模型,探究灵芝提取物是否能通过miR-143-3p影响A25-3s诱导的神经细胞调亡、氧化应激和炎症反应。1材料与方法1.1细胞和主要试剂神经细胞PC12购自中国科学院上海细胞细胞库;胎牛血清、杜氏改良依格尔培养基(DMEM)高糖培养基购自美国HyClone公司;A25-3s购自美国Sigma公司;miR-NC、mi R-143-3pmimic、引物由广州锐博生物科技有限公司设计合成;Lipofectamine2000试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司
17、;噻唑蓝(MTT)试剂盒、凋亡试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、电化学发光(ECL)购自北京索莱宝生物科技有限公司;剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax蛋白)抗体、肌动蛋白(-actin)抗体购自购自美国Cell SignalingTechnology公司;丙二醛(M D A)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、A试剂盒购自南京建成生物工程研究所;TNF-试剂盒、IL-6试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司;TRIzol试剂盒、miRNA逆转录试剂盒、SYBRPremixExTaq试剂
18、盒购自北京百奥莱博科技有限公司。灵芝由本院药剂科提供,具体提取方法参考文献7 1.2方法1.2.1细胞培养和分组PC12细胞常规复苏后置于5%CO2、37 恒温培养箱中进行培养,细胞培养基内含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液。取对数期PC12细胞接种9 6 孔板中,然后使用2 0 mol/L的A25-35处理PC12细胞2 4h建立AD细胞模型,用未经A25-35处理细胞作为空白组;使用灵芝提取物浓度为2.5mg/L、5.0 m g/L、10 m g/L和2 0 mol/L的A25-35处理细胞2 4h,记为低剂量组、中剂量组、高剂量组;按脂质体法将转染miR-NC、m i R-143-3
19、p m i m i c转染细胞后,用10 mg/L灵芝提取物和2 0 mol/L的A25-3s处理细胞2 4h;记为miR-NC+高剂量组、miR-143-3p+高剂量组。细胞转染时按Lipofectamine2000试剂盒操作进行。1.2.2MTT检测细胞增殖取对数期PC12细胞接种9 6 孔板中,按1.2 法处理细胞,培养2 d后,每孔中加人2 0 lMTT试剂,继续反应5h倒掉培养液,每孔中加150 l二甲基亚砜(DMSO)试剂,置于酶标仪57 0 nm处检测细胞吸光度值(A)。1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡取各组PC12细胞加胰酶消化细胞收集细胞上清,加1BindingBuffer制
20、备细胞悬液,依照凋亡试剂盒说明书,加磷脂结合蛋白V(A n n e x i n V)-FI T C和碘化丙啶(PI)试剂5l,避光反应15min,上流式细胞仪检测细胞调亡。1.2.4Western Blotting 法检测 Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表达取各组PC12细胞加放射免疫沉淀(RI PA)裂解液,反应30 min,BCA 法检测定量蛋白浓度,取35g上样蛋白进行12%SDS-PACE凝胶处J Clin Neurol,June 2023,Vol.36,No.3204理,转膜,5%脱脂奶粉封闭培养2 h,加Cleaved-caspase-3(稀释1:8 0 0)、B
21、ax(稀释1:8 0 0)、-actin(稀释1:10 0 0),4孵育过夜,次日加带有标记的二抗(稀释1:50 0 0)室温孵育2 h,加ECL显色,曝光。使用ImageJ软件分析蛋白灰度值。1.2.5ELISA法检测MDA含量、SOD活性、CAT活性、A、T NF-、IL-6 水平耳取各组PC12细胞使用PBS清洗2 次,12 0 0 0 r/min离心5min取上清液,按照试剂盒操作步骤进行,检测MDA含量、SOD活性、CAT活性、A、T NF-、IL-6 水平。1.2.6实时定量RT-PCR(q RT-PCR)检测miR-143-3p表达水平取各组PC12细胞按TRIzol法提取细胞中
22、RNA,测定RNA浓度,严格遵守miRNA逆转录试剂盒操作步骤合成cDNA,然后配置反应体系为1l cDNA,正反引物各0.5l,10l SYBR PremixExTaq,8lddH,O,共2 0 l,在PCR仪器上进行扩增。以U6为内参基因,采用2-ACt法计算miR-143-3p表达水平。1.2.7统计学方法使用SPSS18.0统计学软件来处理本研究相关数据,结果以均数标准差(xs)表示,多组间比较使用单因素方差分析,两组间比较使用t检验。以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1不同浓度的灵芝提取物对A25-35诱导的PC12细胞活性及调亡的影响见图1、表1。与空白组相比,模型组细胞
23、增殖活性显著降低(P0.05),凋亡率显著增加(P0.05);与模型组相比,低剂量组、中剂量组及高剂量组细胞增殖活性均显著增加(均P0.05),而凋亡率均显著降低(均P0.05)。空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组104104104104T10310元103103103102102102102102PI101-10-10101101-100100100100100100101102103104100101102103104100101102103104100101102103104100101102103104AnnexinV-FITC图1流式细胞仪检测细胞凋亡表1不同浓度灵芝提取物对A25
24、-35诱导的PC12细胞活性及凋亡的影响(xs,n=9)组别细胞活性(A值)调亡率(%)空白组1.125 0.106.12 0.51模型组0.634 0.04*24.35 1.85*低剂量组0.751 0.06#19.53 1.36#中剂量组0.926 0.08#12.02 1.02#高剂量组1.056 0.10#8.69 0.73#F值60.017367.026P值0.0000.000注:与空白组比较*P0.05与模型组比较P0.052.2不同浓度灵芝提取物对A25-3s诱导的PC12细胞中Cleaved-caspase-3、Ba x 蛋白的表达影响见图2、表2。与空白组相比,模型组Clea
25、ved-caspase-3、Bax蛋白表达显著增加(均P0.05);与模型组相比,低剂量组、中剂量组、高剂量组Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达显著降低(均P0.05)。2.3不同浓度灵芝提取物对A25-35诱导的PC12细胞培养上清液中MDA含量、SOD活性及CAT活性的影响见表3。与空白组相比,模型组MDA含量显空白组Cleaved-caspase-331 kDa-actin42kDaBax21 kDa-actin42kDa图2Westernblotting法检测细胞中Cleaved-caspase-3、Ba x 蛋白的表达著增加(P0.05),SO D 活性及CAT活性显
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