连贯抗病毒颗粒的HPLC指纹图谱研究及含量测定.pdf
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1、药学与临床研究药学PharmaceuticalandClinicalResearch研究连贯抗病毒颗粒的HPLC指纹图谱研究及含量测定陆杰霖,郭曼曼,殷文娟,钱叶飞,汪怡1*1昆山市中医医院,昆山2 45347;2 苏州市药品检验检测研究中心,苏州2 1510 4摘要目的:采用指纹图谱结合多成分含量测定,提升院内制剂连贯抗病毒颗粒质量标准。方法:采用HPLC-UV法,色谱柱为YMC-Pack ProCis(2 50 mm4.6 mm,5m)色谱柱,流动相为乙睛-0.2%甲酸水溶液,梯度洗脱,流速为1.0 mLmin,检测波长为2 8 0 nm,柱温35,进样量为10L;建立10 批次连贯抗病毒
2、颗粒指纹图谱;同时测定了连翘酯苷A、连翘苷和咖啡酸的含量。结果:指纹图谱中,共标定了13个共有峰,指认了其中4个色谱峰,并测定连翘酯苷A、连翘苷及咖啡酸的含量分别为13.2 2 18.0 5、2.432 3.540.0.2 7 11 0.342 8 mg*g。结论:本文通过指纹图谱定性、含量定量方式,多维度提升院内制剂连贯抗病毒颗粒的质量控制水平。关键词连贯抗病毒颗粒;HPLC指纹图谱;质量控制中图分类号R927.2文献标志码A文章编号号16 7 3-7 8 0 6(2 0 2 3)0 4-317-0 4流行性感冒是流感病毒引起的一种急性呼吸道感染,在中医学被称为“时行感冒”,属疫类(即传染病
3、)。医院制剂连贯抗病毒颗粒由连翘、贯众、香需及青蒿组成,具有疏表达邪、清热解毒之功效,治疗病毒性感冒、支气管炎、肺炎及病毒感染性疾病。连翘药理结果表明,其具有抗甲型流感病毒作用,也有很好的抗呼吸道合胞病毒的作用 2-4;绵马贯众能降低感染FM1株流感病毒的小鼠肺指数,降低病毒引起的肺损伤,香需及青蒿也有相似的抗流感病毒活性,能减轻小鼠肺部的病变 6,7 。目前,该制剂的质量标准仅检测酸碱度、密度等,无法适应现代中药制剂对质量控制的要求。本文采用HPLC法建立连贯抗病毒颗粒的指纹图谱,同时测定了制剂中咖啡酸、连翘酯苷A及连翘苷的含量,提升院内制剂质量控制水平。1仪器与试药e2695型色谱系统(美
4、国沃特世公司);BT25S型分析天平(德国赛多利斯公司);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。咖啡酸(MUST-22062118)、芦丁(MUST-22022507)、连翘酯苷A(M U ST-2 2 0 3310 5)、连翘苷(M U ST-2 2 0 42 111)对照品均购于成都曼斯特生物*基金项目昆山市中医医院青年科学基金项目(2 0 2 0 QNJ12)作者简介陆杰霖,女,主管中药师E-mail:*通信作者汪怡,女,副主任中药师E-mail:收稿日期2023-04-06修回日期2 0 2 3-0 7-17科技有限公司,纯度均98%。10 批次连贯抗病毒颗粒均
5、由昆山市中医医院制剂室提供,样品编号(批号)分别为LG1(2 0 2 1112 0)、LG 2(2 0 2 1112 5)、LG3(20220106)、LG 4(2 0 2 2 0 12 0)、LG 5(2 0 2 2 0 30 4)LG6(20220501)、LG 7(2 0 2 2 0 50 8)、LG 8(2 0 2 2 0 7 0 7)、LG9(20220725)、LG 10(2 0 2 2 0 8 0 1)。甲醇、乙腈为色谱纯;其余试剂为分析纯。2方法与结果2.1试液与条件供试品溶液:取装量差异下的本品,研细,取约2.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加稀乙醇25mL,称重,超声处
6、理(功率6 0 0 W,频率40 kHz)30min,冷却至室温,再用稀乙醇补足失量,摇匀,高速离心,取上清液,过0.45m有机滤膜,取续滤液。对照品溶液:分别取连翘酯苷A、连翘苷、芦丁、咖啡酸对照品适量,精密称定,加稀乙醇配制成浓度分别为4938.13、338 6.8 8、133.40 和6 48.8 3gmL-1的对照品储备液。色谱条件:YMC-Pack Pro Cis(250mm4.6mm,5m)色谱柱;流动相A为乙腈,流动相B为0.2%甲酸水,性线梯度洗脱(A:B):0 mi n(10:90)15mi n(10:90)60min(16:84)90 min(28:72)110 min(7
7、0:30);柱温35;检测波长2 8 0 nm。2.2#指纹图谱方法学考察2.2.1进样精密度试验取编号LG8样品供试品溶液,连续进样6 次,以连翘酯苷A为参照峰,记录3172023Aug;31(4)连贯抗病毒颗粒的HPLC指纹图谱研究及含量测定并计算得各共有峰相对保留时间RSD0.77%((n=6),相对峰面积RSD4.98%(n=6),表明仪器精密度良好。2.2.2重复性试验取编号LG8样品供试品溶液共6 份,进样测定,以连翘酯苷A为参照峰,记录并计算得各共有峰相对保留时间RSD0.97%(n=6),相对峰面积RSD4.77%(n=6),表明该方法重复性良好。2.2.3稳定性试验取编号LC
8、8样品供试品溶液,于0、4、8、12、16、2 0 h,进样测定,以连翘酯苷A为参照峰,记录并计算得各共有峰相对保留时间RSD0.73%(n=6),相对峰面积RSD0.92,说明10 批连贯抗病毒颗粒指纹图谱有较好的相似性,生产稳定性较好。2.3.3共有峰的标定与归属对10 批样品图谱进行分析,其中连翘酯苷A紫外响应明显,色谱保留时间适中,且为处方中主要活性成分,故以其为参照峰(s),10批次连贯抗病毒颗粒的13个共有峰的保留时间及相对峰面积见表1。共标定了13个共有峰,通过相对保留时间和紫外光谱与对照品一致的318比较,指认出4号峰为咖啡酸、6 号峰为芦丁、8 号峰为连翘酯苷A,13号峰为连
9、翘苷,见图2。表110 批次连贯抗病毒颗粒各峰保留时间及相对峰面积(n=10)峰号保留时间(s)17.15 0.14212.00 0.17313.02 0.35417.89 0.34550.46 0.58654.65 0.54759.44 0.48861.21 0.44963.31 0.501065.63 0.311170.94 0.241276.75 0.201386.01 0.098RS10S9S8S7S6S5S4S3S2S1使用中药色相对峰面积0.0365 0.00310.0264 0.00220.0230 0.00780.1275 0.198 00.606 2 0.01670.0610
10、 0.00470.3344 0.02121.0000 0.00000.0301 0.00700.0944 0.05520.03200.00500.0418 0.01160.1053 0.01591310623010203040506070 80 90100110t/min图2连贯抗病毒颗粒指纹图谱共有模式图4.咖啡酸;6.芦丁;8.连翘酯苷A;13.连翘苷分别取连翘、香、贯众、青蒿单味药,按照处方工艺制备单味药对照品。按“2.1 项下方法制备单味药对照品溶液,按“2.1 项下条件进行测定,记录色谱图,见图3。将单味药对照品与样品图谱进行比对1、4、5、6、7、8、9、10、13号峰来自于连翘;
11、12 号峰为连翘、贯众和香的共有峰;3号峰来自于香;2 号峰和11号峰为香和青蒿的共有峰。2.4连贯抗病毒颗粒中3种成分含量测定2.4.1系统适用性试验精密吸取“2.1 项下制备的咖啡酸储备液1mL、连翘酯苷A储备液7 mL、连翘苷储备液2 mL,置2 5mL容量瓶中,用稀乙醇定容,得混合对照品溶液;取编号LG8的连贯抗病毒颗粒供试品溶液;精密吸取混合对照品稀释液与供试品溶液各10 L,按“2.1 项下色谱条件分别进样,得到混合对照品HPLC图及连贯抗病毒颗粒HPLC图,见图4。结果显示,咖啡酸、连翘酯苷A及连翘苷之间分离度良好,理论塔板数均大于50 0 0,分离度均大于1.5。11药学与临床
12、研究药学Pharmaceutical and Clinical Research研究积并按标准曲线法计算样品含量。结果供试品中咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷平均含量分别为0.32 38、16.4115、2.950 8 m g g(n=6),R SD 分别为1.40%、1.54%、1.8 3%(n=6),表明该方法重复性良好。1096T015图3连贯抗病毒颗粒色谱峰归属图451234015图4混合对照品溶液(A)和连贯抗病毒颗粒(B)HPLC图2.4.2线性关系精密吸取“2.1 项下的咖啡酸储备液1mL、连翘酯苷A储备液7 mL、连翘苷储备液2mL,定容至10 mL,配制成储备液,以稀乙醇稀释配制成
13、不同质量浓度的系列混合对照品溶液,(咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷质量浓度分别为5.19 64.88 g mL-l,276.54 3 456.69.54.19 677.38 gmL-)。进样测定,记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,质量浓度为横坐标(X)进行线性回归,得到标准曲线,咖啡酸回归方程Y=3.30X104-1.10103(r=0.9996),连翘酯A回归方程Y=9.94X103+1.04105(r=0.9995),连翘昔回归方程Y=6.50X10+7.31103(r=0.9996),均与峰面积线性关系良好。2.4.3进样精密度试验取线性曲线中间点的对照品溶液适量,按“2.1”项下条件,连
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