灵芝产漆酶工艺优化.pdf
《灵芝产漆酶工艺优化.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《灵芝产漆酶工艺优化.pdf(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、2023 年第 8 期灵芝产漆酶工艺优化马亚萍1,2,文武1,2,暴霆杰1,2,刘民昌1,2,刘洋1,2,张荣亚1,2,李力1,2,何玲英1,2,曾正蓉1,2,杨小琴1,2,*张艇1,2(1.四川中烟工业有限责任公司 技术中心,四川 成都 610066;2.卷烟减害降焦四川省重点实验室,四川 成都 610066)摘要:通过单因素试验筛选出最适氮源、碳源;通过 Plackett-burman 设计从酵母浸粉、玉米浆、烟梗粉末、KH2PO4、MgSO4 7H2O、麸皮、维 B1、接种量、转速、pH 值共 10 个因素中筛选出对灵芝产漆酶影响较大的因素,采用最陡爬坡试验接近最大响应区,通过 Box-
2、behnken 响应面试验建立试验因素与漆酶酶活力的回归模型。确定发酵最优条件是酵母浸粉质量浓度 3 g/L,玉米浆质量浓度 20 g/L,烟梗粉末质量浓度 10 g/L,KH2PO4质量浓度 1.1 g/L,MgSO4 7H2O 质量浓度 1.04 g/L,麸皮质量浓度 31.6 g/L,维 B1质量浓度 0.1 g/L,接种量 6%,转速 165 r/min,pH 值 3.8,发酵时间112125 h,此时发酵液漆酶活力达到 65 387 U/L。在 50、添加量 10%(按烟梗质量分数的 10%计算)、发酵时间6 h 的条件下,烟梗木质素降解率达到 38%。关键词:漆酶;灵芝;发酵;酶活
3、;烟梗中图分类号:S567.3文献标志码:Adoi:10.16693/ki.1671-9646(X).2023.08.043(1.Technology Center,China Tobacco Sichuan Industrial Co.,Ltd.,Chengdu,Sichuan 610066,China;2.Key Laboratoryfor Harmful Components and Tar Reduction in Cigarette of Sichuan Province,Chengdu,Sichuan 610066,China)Firstly,optimum nitrogen so
4、urce and carbon source were screened out by single factor experiment,and thenKH2PO4,rotational speed and pH were found to have significant effects on the Ganoderma lucidum laccase production from 10factors including yeast extract,corn syrup,tobacco stem powder,KH2PO4,MgSO4 7H2O,bran,VB1,inoculation
5、amount,rotational speed,pH through Plackett-Burman design.Subsequently,the optimal response region was approached by thesteepest ascent method.Finally,the regression between these three factors and the laccase activity was established by theBox-Behnken response surface methodology.The results determ
6、ined the optimal fermentation conditions were yeast extract3 g/L,corn syrup 20 g/L,tobacco stem powder 10 g/L,KH2PO41.1 g/L,MgSO4 7H2O 1.04 g/L,bran 31.6 g/L,VB10.1 g/L,inoculation amount 6%,rotation speed 165 r/min,pH 3.8,fermentation time 112125 h,at this time fermentationbroth laccase activity re
7、ached 65 387 U/L.Under the conditions of 50,addition amount w.t 10%,and fermentation time of6 h,the degradation rate of tobacco stem lignin reached 38%.laccase;Ganoderma lucidum;fermentation;enzyme activity;tobacco stems收稿日期:2022-04-04基金项目:四川中烟工业有限责任公司院士科研项目(HX201801,GY202004)。作者简介:马亚萍(1990),女,硕士,助理
8、工程师,研究方向为食品发酵技术。*通讯作者:张艇(1981),男,硕士,高级工程师,研究方向为产品配方。木质素广泛分布于植物的细胞壁中,是一种结构复杂的有机高分子化合物1,在木本植物细胞壁中,木质素含量为 20%35%,在草本植物细胞壁中,木质素含量为 15%25%2。其结构复杂,不易降解,极大地限制了生物质资源的生产3,并且燃烧时产生刺激性、木质气,每年有 5 亿 6 亿 t 未得到充分利用4,有数十万吨的烟梗被废弃,对环境造成了严重的污染,对生物质资源产生了极大浪费。漆酶是一种分布广泛的多酚氧化酶,以分子氧作为最终电子受体,是重要的木质纤维降解酶之一,在生物质能源、染料脱色、生物漂白、食品
9、加工、污水处理等领域有深远的应用前景5。与细菌、植物产的漆酶相比,真菌产的漆酶具有更高的金属离子耐受性、热稳定性和底物催化氧化性6。灵芝属于白腐真菌,能产生包括漆酶在内的多种木质纤维素降解酶,具有真菌产漆酶良好的酶学特性,在工农业、环境领域和科研工作中受到了广泛的关注。柴新义等人7从 11 株野生大型真菌中文章编号:1671-9646(2023)08b-0061-06第 8 期(总第 582 期)农产品加工No.82023 年 8 月Farm Products ProcessingAug.农产品加工2023 年第 8 期筛选出有柄树舌灵芝具有较高的产漆酶活性。谢玉清等人8优化无柄灵芝菌培养基,
10、发现配方为干酪素质量浓度 25 g/L、麦麸质量浓度 15 g/L、葡萄糖质量浓度 10 g/L 和酒石酸铵质量浓度 6 g/L,相应的菌漆酶活性达到 15 800 U/L。李彩联等人9开展白腐菌固态发酵产酶发酵条件优化,以麸皮为发酵基质,接种量 5%,发酵 120 h 时漆酶活性最大。于建军等人10采用响应面法优化漆酶降解梗丝木质素工艺,显著改善香气质、香气量、余味和刺激性。但前人研究一般试验设计较为简单或者试验酶活较低,通过单因素试验设计选出最佳碳氮源,通过 Plackett-bur-man 试验筛选出影响显著的因素,结合最陡爬坡试验,最后采用 Box-behnken 中心组合试验得到最优
11、发酵工艺条件,在此条件下获得的漆酶酶活显著提高,大大提高烟梗处理水平,减少烟梗废弃化处理。1材料与方法1.1.1菌种灵芝菌(Ganoderma lucidum)本实验室保藏。1.1.2培养基马铃薯葡萄糖水(生物试剂),海博生物公司提供;葡萄糖、MgSO4 7H2O、KH2PO4、维 B1、NaOH、柠檬酸、K2HPO4(分析纯),国药集团化学试剂有限公司提供;酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、玉米浆(生物试剂),国药集团化学试剂有限公司提供;麸皮(食品级),山东省青岛市面粉加工厂提供。PDB 培养基:马铃薯葡萄糖水质量浓度 26.1 g/L,pH 值自然,于 121 下灭菌 15 min;原
12、始发酵培养基:葡萄糖质量浓度 20 g/L,酵母粉质量浓度 5 g/L,蛋白胨质量浓度 10 g/L,MgSO47H2O 质量浓度 1 g/L,KH2PO4质量浓度 1 g/L,维 B1质量浓度 0.1 g/L,pH 值自然,于 121 灭菌 15 min。1.1.3仪器与设备FD100A 型高压灭菌锅,致微仪器有限公司产品;BCM-1000A 型洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司产品;ZQWY-200V 型卧式全温振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司产品;1810 型紫外分光光度计,上海普析产品;JE3002GE 型电子天平,梅特勒产品。1.2.1菌株培养方法(1)菌液制备。将 250 mL
13、三角瓶中装入 50 mLPDB 培养基,从平板上挑取 34 个菌饼接种于 50 mLPDB 培养基中,于 30 下以转速 150 r/min 培养 5 d,用玻璃珠打散菌丝体备用。(2)摇瓶发酵培养。配制 50 mL 发酵培养基盛放于 250 mL 锥形瓶中,加入 3 mL 培养好的菌液至发酵培养基中,于 30 下以转速 180 r/min 培养 5 d,测定发酵液漆酶酶活力。1.2.2漆酶酶活力测定方法酶活测定方法为:3 mL 反应体系里含有浓度为2 mmoL/L 的 ABTS 溶液 0.5 mL、浓度为 0.05 moL/L且 pH 值为 3 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 2 mL 和粗酶液
14、(发酵液过 0.22 滋m 微孔滤膜)0.5 mL,于45 下反应 5 min,测定 OD420。漆酶=106V总A420着V酶t.式中:着系数,值为 3.6104,L/(mol cm);V总漆酶酶活测定反应体系总体积,mL;V酶添加酶液体积,mL;t反应时间,min。每组试验平行培养 3 瓶,每瓶发酵液平行测量3 次漆酶酶活力,取平均值。1.2.3单因素试验筛选氮源、碳源、烟梗粉末(1)培养基氮源的优化。以原始培养基为基础,分别以玉米浆、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨为氮源,添加质量浓度为 10,15,20,25 g/L,按菌液体积的6%接种量接种同一瓶菌液,摇瓶培养 120 h,测定发酵液漆酶酶
15、活力。(2)培养基碳源的优化。以原始培养基为基础,分别以葡萄糖、麸皮、蔗糖、淀粉为碳源,添加质量浓度为 5,10,15,20 g/L,按 6%的菌液接种量接种同一瓶菌液,摇瓶培养 120 h,测定发酵液漆酶酶活力。(3)烟梗粉末的优化。以原始培养基为基础,产酶诱导因子烟梗粉末添加质量浓度分别设置为 0,5,10,15 g/L,按 6%的菌液接种量接种同一瓶菌液,摇瓶培养 120 h,测定发酵液漆酶酶活力。1.2.4Plackett-burman 试验根据前期单因素预试验结果,选取玉米浆为氮源、麸皮为碳源,考查酵母浸粉(2 g/L 和 3 g/L)、玉米浆(20 g/L 和 30 g/L)、烟梗
16、粉末(10 g/L 和 15 g/L)、KH2PO4(1 g/L 和 1.5 g/L)、MgSO4 7H2O(1 g/L 和1.5 g/L)、麸皮(30 g/L 和 45 g/L)、维 B1(0.1 g/L 和0.15 g/L)、接种量(6%和 9%)、转速(140 r/min 和200 r/min)、pH 值(3.8 和 5.7)共 10 个因素,设 1 个虚拟变量。Plackett-burman 试验的因素和水平见表 1。1.2.5最陡爬坡试验设计按照一定梯度设置 KH2PO4、转速、pH 值,通过测定漆酶酶活,进而确定最优量。1.2.6Box-behnken 响应面法优化在 1.2.5
17、节试验结果的基础上,以 KH2PO4、转速、pH 值为自变量,设计三因素三水平试验。1.2.7发酵时间的优化622023 年第 8 期表 1Plackett-burman 试验的因素和水平水平酵母浸粉/g L-1玉米浆/g L-11-1232030烟梗粉末/g L-11015KH2PO4/g L-11.01.5MgSO4 7H2O/g L-1麸皮/g L-1维 B1/g L-11.01.530450.100.15接种量/%69转速/r min-1pH 值1402003.85.7在上述发酵条件下,测定不同发酵时间下的发酵液漆酶酶活,确定较优发酵时间。1.2.8灵芝发酵液处理烟梗采用上述优化好的灵
18、芝发酵液,按烟梗质量分数的 5%,10%,15%,20%,25%均匀喷洒到烟梗中,另外均匀喷洒水,使得烟梗最终含水率达到35%,密封好放入 50 的恒温培养箱中,处理 6 h,80 烘 2 h,按照国标 YC/T 347-2010 测定样品的木质素含量。1.2.9数据处理采用 Design Expert 12 开展试验设计和结果分析。2结果与分析2.1.1碳源筛选培养基氮源筛选见图 1。原始发酵培养基分别添加了玉米浆、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨之后的发酵液酶活,由图 1 可知,氮源玉米浆 大豆蛋白胨 牛肉膏蛋白胨,且玉米浆质量浓度 20 g/L 时,酶活最高。因此,选用玉米浆作为碳源,质量浓度
19、20 g/L。因为玉米浆中香草酸和阿魏酸是有效的产漆酶促进剂11-12。2.1.2碳源的优化培养基碳源筛选见图 2。原始发酵培养基分别添加了葡萄糖、麸皮、蔗糖、淀粉之后的发酵液酶活,由图 2 可知,碳源蔗糖、淀粉 麸皮 葡萄糖,但是以蔗糖、淀粉为碳源时,灵芝菌丝体固形物含量高,接近糊状。因此,优选麸皮作为培养基的碳源。2.1.3产酶诱导因子的优化烟梗中含有丰富的纤维素,并且成本低、易获取,因此采用烟梗粉末作为灵芝产漆酶诱导因子。灵芝产漆酶随烟梗粉末质量浓度的变化见图 3。由图 3 可知,05 g/L,漆酶酶活快速增加,510g/L,增加放缓,1015g/L,趋于平稳。当添加10g/L的烟梗粉末
20、时,漆酶酶活增加到对照组的 1.59 倍。通过 Plackett-burman 试验,筛选出对灵芝产酶的关键因素。Plackett-burman 试验结果见表 2,Plackett-bur-man 试验方差分析结果见表 3。由表 2 表 3 可知,结果显著(p0.05),确定系数 0.98,说明模型有较高的拟合度和可靠性。其中,KH2PO4(p0.05)、转速(p0.05)、pH 值(p0.01)这 3 个因素对漆酶酶活存在显著影响。试验发现,所有 pH 值 5.7 的发酵液均染菌,酶活较低,可能是因为 pH 值 5.7 的发酵液不适合灵芝菌的生长,导致培养过程中杂菌生长,与陈建军等人13的研
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 灵芝 产漆酶 工艺 优化
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。