基于自噬理论探讨活血解毒降糖方对糖尿病动脉粥样硬化的影响.pdf
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1、论著基于自噬理论探讨活血解毒降糖方对糖尿病动脉粥样硬化的影响符显昭蒋晓凤陈佳俊申亚亚(右江民族医学院附属医院广西 百色)摘要 目目的的 观察活血解毒降糖方对糖尿病动脉粥样硬化的干预作用及对自噬通路的影响探讨其可能作用机制 方方法法 取 雄性 大鼠随机选择 只作为正常组余大鼠采用链脲佐菌素腹腔注射 高脂喂养方法建立糖尿病模型然后采用主动脉球囊拉伤术建立动脉粥样硬化模型 将糖尿病动脉粥样硬化造模成功大鼠随机分为模型组、西药组、活血解毒降糖低剂量组、活血解毒降糖高剂量组每组 只 活血解毒降糖低、高剂量组分别给予活血解毒降糖方./()和./()灌胃西药组给予含格列喹酮./和贝那普利./的蒸馏水稀释液灌
2、胃正常组和模型组给予等容积蒸馏水灌胃均 次/连续灌胃 个月 取血检测糖化血红蛋白及血清三酰甘油()、低密度脂蛋白胆固醇()水平 染色观察主动脉病理形态透射电镜观察主动脉细胞自噬及超微结构 法检测主动脉组织中肌醇需求酶()、肿瘤坏死因子相关受体因子()、葡萄糖调节蛋白()表达量 法检测主动脉组织中、微管相关蛋白 轻链 蛋白 ()蛋白表达情况 结结果果 模型组大鼠糖化血红蛋白及血清、水平均明显高于正常组(均.)染色显示动脉内膜增厚有集中的动脉粥样硬化斑块主动脉组织病理积分明显高于正常组()透射电镜观察主动脉细胞自噬小体明显增多细胞浆内充满肿胀的线粒体呈空泡样改变动脉组织中、相对表达量和、蛋白相对表
3、达量均明显高于正常组(均.)与模型组比较各药物组大鼠糖化血红蛋白及血清、水平均明显降低(均.)主动脉组织损伤减轻细胞自噬小体和空泡形成减少动脉组织中 、相对表达量和、蛋白相对表达量均明显降低(均.)各药物组间比较活血解毒降糖高剂量组各指标改善更明显 结结论论 活血解毒降糖方可通过抑制糖尿病代谢紊乱所致的内质网应激调节内质网稳态抑制动脉内膜细胞过度自噬保护动脉关键词 糖尿病动脉粥样硬化活血解毒降糖方内质网应激自噬:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 符显昭男博士研究员研究方向为糖尿病心血管疾病并发症基金项目 国家自然科学基金地区项目()广西自然科学基金项目()():.现代中西医
4、结合杂志 ()./()./()././.()()()()()().()(.)().(.)(.).:目前糖尿病患病率呈上升趋势且明显年轻化给人类健康带来了严重的影响 动脉粥样硬化是糖尿病的常见慢性并发症其是心脑血管疾病的独立危险因素 研究发现细胞自噬、内质网应激和炎症介质等信号通路在调控动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用 细胞自噬是存在于真核生物进化过程中的一种高度保守的降解和回收利用生物大分子和受损细胞器的过程其在动脉粥样硬化形成发展过程中同样扮演着重要的角色研究发现适度的自噬对动脉粥样硬化具有保护作用而过度的自噬会导致细胞死亡降低斑块的稳定性导致斑块破裂发生急性临床事件 因此调控血管细胞自
5、噬以拮抗动脉粥样硬化是目前靶向药物研究的热点 中医理论认为糖尿病动脉粥样硬化病变是在气阴两虚并燥热内蕴病机基础上不断发展而来气虚无力运血则血行缓慢而致瘀燥热内蕴过久则炼津为痰痰瘀互结日久可化毒导致瘀血、痰浊、热毒滞留并沉积于脉络形成斑块(即动脉粥样硬化斑块)前期实验研究发现活血解毒降糖方能减轻糖尿病大鼠机体炎症反应减少主动脉细胞凋亡抑制内质网应激偶联炎症反应 本研究观察了活血解毒降糖方对糖尿病大鼠主动脉细胞自噬相关蛋白表达的影响旨在从内质网应激 细胞自噬角度探讨其作用机制为糖尿病动脉粥样硬化的防治提供实验依据 实验材料与方法 实验动物雄性 大鼠 只体重 购于广西医科大学实验动物中心合格证号:(
6、桂)大鼠饲养于右江民族医学院动物实验中心普通饲料适应性喂养 保持室温 自然采光相对湿度 本实验已通过右江民族医学院实验动物伦理委员会审查()实验药物 活血解毒降糖方(由人参 、麦冬 、五味子、山茱萸、生地、山药、大黄 、鳖甲 、桃仁 、丹皮 、黄连 等 味中药组成)药材购自右江民族医学院附属医现代中西医结合杂志 ()院符合中华人民共和国药典药品质量控制标准 先将各味中药置于约 倍量超纯水中室温浸泡 再用不锈钢提桶煎煮.将浓缩药液转移至烘干箱中 烘干 制成浸膏每 浸膏剂量相当于原生药 保鲜膜将浸膏密封放入 冰箱冷冻保存用时取出室温解冻 格列喹酮(北京万 辉 双 鹤 药 业 有 限 责 任 公 司
7、 国 药 准 字)贝那普利(北京诺华制药有限公司国药准字)主要仪器与试剂 型荧光定量 仪(美国罗氏公司)型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)型切片机(德国 公司)台式高速低温离心机(德国 公司)型组织脱水机(德国徕卡公司)型全自动热蒸汽灭菌器(日本 公司)型制冰机(上海三洋生物科技有限公司)型超净工作台(中国苏州医疗设备厂)血糖仪(武汉博士德生物工程有限公司)链脲佐菌素(货号:上海源叶生物科技有限公司)糖化血红蛋白 试剂盒(货号:北京华越洋生物科技有限公司)(货号:公司)、微管相关蛋白 轻链 蛋白(货号:公司)实验方法取 只 大鼠作为正常组腹腔内注射生理盐水普通饲料喂养 其余大鼠空腹 后单次腹腔注
8、射 /后用血糖试纸检测空腹血糖()以 次./为糖尿病造模成功随后高脂饲料(含普通饲料、胆固醇.、蛋黄粉、胆盐.、猪油 江苏省协同生物工程有限公司)喂养 个月大鼠禁食后腹腔注射.戊巴比妥钠/麻醉无菌条件下做颈正中切口分离左颈外动脉结扎远心端向心脏方向插入.球囊约进入后充盈球囊感到阻力后缓慢回拉约 放空球囊再进入 充盈、回拉重复 次退出球囊结扎近心端逐层缝合术后肌注青霉素钠 随后继续高脂饲料喂养 个月 将糖尿病动脉粥样硬化造模成功大鼠随机分为模型组、西药组、活血解毒降糖低剂量组、活血解毒降糖高剂量组各 只活血解毒降糖低、高剂量组分别给予活血解毒降糖方./()和./()灌胃(室温下解冻后将浸膏置于
9、管中加入生理盐水经涡旋震荡配制成 混悬液)西药组给予含格列喹酮./和贝那普利./(按成人临床用药剂量的.倍计算)的蒸馏水稀释液灌胃正常组和模型组给予等容积蒸馏水灌胃均 次/连续灌胃 个月灌胃期间各造模组大鼠继续高脂饲料喂养 取材灌胃结束后采用 水合氯醛溶液/腹腔注射麻醉大鼠颈静脉采血室温下静置 下 /离心分离血清 冰箱保存 大鼠因失血过多死亡后在冰上迅速取出胸主动脉用生理盐水将管腔内血液冲洗干净一部分用多聚甲醛固定用于 染色进行主动脉病理观察一部分用 戊二醛溶液浸泡后置 冰箱保存用于电镜观察细胞自噬及动脉超微结构其余动脉放入液氮 冷藏用于内质网应激分子 和自噬相关蛋白检测 检测指标及方法 糖化
10、血红蛋白及血清三酰甘油()、低密度脂蛋白胆固醇()水平采用 法测定糖化血红蛋白水平实验步骤严格按照说明书进行 采用全自动生化仪测定、水平 主动脉组织病理形态从冰箱中取出主动脉经乙醇脱水石蜡包埋切 薄片 烘箱烘烤二甲苯脱蜡苏木素染色 自来水冲洗 盐酸乙醇分化 自来水浸泡 置伊红液 自来水冲洗再乙醇脱水 倍显微镜下采集图像并进行半定量分析 级(分):血管内皮光滑表面致密细胞排列整齐内膜完整 级(分):血管内皮结构较光滑细胞排列比较整齐内膜完整 级(分):细胞肿胀内膜增厚出现动脉粥样硬化斑块 级(分):细胞肿胀明显排列不齐内膜增厚粥样硬化斑块较多 级(分):血管内皮细胞脱落细胞肿胀明显排列紊乱内膜明
11、显增厚有集中的动脉粥样硬化斑块 主动脉细胞自噬及超微结构将主动脉从戊二醛固定液中取出用 锇酸溶液固定 吸出固定液用./.漂洗样品 次每次 梯度浓度()乙醇溶液对样品进行脱水纯丙酮处理 用 环氧树脂包埋制成超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅溶液双重染色 透射电镜观察(加速电压 )调节物镜聚焦旋钮至图片清晰拍照现代中西医结合杂志 ()主动脉组织中内质网应激分子 表达情况 采用 法检测:从 冰箱取出主动脉加入 液在研钵中研磨静置 使得核蛋白与核酸完全分离/离心 取上清液加入 氯仿/离心 取上清液加入异丙醇静置 下/离心 弃上清液加 乙醇漂洗沉淀 下 /离心 弃上清液再加 无水乙醇沉淀 下 /离心 弃上清
12、室温干燥后加入 的 水溶解 利用超微分光光度计测定溶解后 浓度和纯度当/在.时表明所提取 纯度较好 将 反转录为 然后将获得的 进行扩增步骤参数:设 个复孔点样置于 仪上进行 反应反应条件:变性 次循环 记录达到所设定的阈值所经历的循环数即 值利用溶解曲线检测引物的特异性采用 计算目的基因表达量 目的基因肌醇需求酶()、肿瘤坏死因子相关受体因子()、葡萄糖调节蛋白()和内参基因甘油醛 磷酸脱氢酶()引物由康为世纪生物科技有限公司设计合成引物序列见表 主动脉组织中、蛋白表达情况 采用 法检测:从 冰箱取出主动脉碎裂加 冷 液匀浆冰上裂解 放入离心管中 /离心 取上清置于新的离心管中用 试剂盒检测
13、其浓度表 引物序列引物名称上游引物序列下游引物序列引物长度/用 电泳和转膜后将 膜放入孵育盒加入 脱脂奶粉封闭液摇床振荡 洗膜 次将膜放入含一抗稀释液的孵育盒中 摇床振荡孵育过夜第 天取出在室温中振荡 吸弃一抗用 洗 次用 脱脂奶粉封闭液稀释二抗室温摇床振荡反应 二抗反应结束后回收二抗用 洗膜 次 滴加混合液发光试剂充分接触反应 使用 成像仪拍照存储图片采用 软件测定并分析灰度值 统计学方法 应用 .统计软件处理数据符合正态分布计量数据用均数 标准差()表示组间比较采用单因素方差分析()如果方差齐两两比较采用 法方差不齐采用 法 .为差异有统计学意义 结 果 各组大鼠糖化血红蛋白及血清、水平比
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