固定化蛋白质色谱模型的建立及其在先导化合物筛选中的应用.pdf
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1、h t t p:/X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t药物分析固定化蛋白质色谱模型的建立及其在先导化合物筛选中的应用张建丰1,梁 琦2,李刚刚1,延保国1*1.西安市第八医院药剂科,西安 7 1 0 0 6 1;2.西北大学生命科学学院,西安 7 1 0 0 6 9摘要:目的 建立基于固定化蛋白质的色谱模型,并将其应用于先导化合物的快速筛选和初步评价。方法 构建融合卤代烷烃脱卤素酶标签(h a l o g e n a t e d a l k a n e d e h a l o g e n a s e t a g g e d,H a l o-t a g g e d)的2-肾
2、上腺素受体(2-a d r e n o c e p t o r,2-A R)重组质粒,用热击法将该重组质粒导入大肠杆菌B L 2 1(D E 3),经诱导表达获得大量融合H a l o-t a g的2-A R,通过H a l o-t a g与6-氯己酸修饰的微球的特异性反应将细胞裂解液中的2-A R一步捕获至硅胶表面,获得2-A R色谱固定相,用该色谱固定相测定甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特罗的结合常数为4.91 03、9.91 03、2.01 04 Lm o l-1,对应的解离速率常数为8.1、1 3.8、5.7 s-1,建立固定化蛋白质色谱模型。结果 用该方法对先导化合物X C 2 6 7的成
3、药性进行评价,测得其与2-A R的结合常数为4.4 1 03 Lm o l-1、解离速率常数为8.7 s-1,证实X C 2 6 7是2-A R的潜在激动剂。结论 建立的固定化蛋白质色谱模型能用于先导化合物的筛选和快速评价,方法特异性高,稳定性好,为其他先导化合物的前期评价提供了方法学借鉴。关键词:固定化蛋白质;2-肾上腺素受体;色谱D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 4-2 4 0 7.2 0 2 3.0 5.0 0 7中图分类号:R 9 1 7 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 4-2 4 0 7(2 0 2 3)0 5-0 0 3 7-0 5C o n
4、 s t r u c t i o n o f a c h r o m a t o g r a p h i c m o d e l b a s e d o n t h e i mm o b i l i z e d p r o t e i n a n d i t s a p p l i c a t i o n i n l e a d c o m p o u n d s c r e e n i n gZ HAN G J i a n f e n g1,L I AN G Q i2,L I G a n g g a n g1,YAN B a o g u o1*1.D e p a r t m e n t o
5、f P h a r m a c y,t h e E i g h t h H o s p i t a l o f X ia n C i t y,X ia n 7 1 0 0 6 1,C h i n a;2.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e,N o r t h w e s t U-n i v e r s i t y,X ia n 7 1 0 0 6 9,C h i n aA b s t r a c t:OO bb jj ee cc tt ii vv ee A c h r o m a t o g r a p h i c m o d e l b a s e
6、 d o n t h e i mm o b i l i z e d p r o t e i n w a s e s t a b l i s h e d a n d a p p l i e d t o t h e r a p i d s c r e e n i n g a n d p r e l i m i n a r y e v a l u a t i o n o f l e a d c o m p o u n d s.MM ee tt hh oo dd ss T h e h a l o g e n a t e d a l k a n e d e h a l o g e n a s e t a
7、 g g e d(H a l o-t a g g e d)2-a d r e n o c e p t o r(2-A R)w a s g e n e t i c a l l y e n g i n e e r e d i n t h e p l a s m i d o f p R e c e i v e r-B 0 2.T h i s p l a s m i d w a s i n t r o d u c e d i n E.c o l i B L 2 1(D E 3)b y h e a t-s h o c k t r e a t m e n t a n d e x p r e s s e d
8、 u s i n g t h e a u t o-i n d u c t i o n m e d i u m t o o b t a i n t h e H a l o-t a g g e d 2-A R.W e p r e p a r e d t h e 2-A R s t a t i o n a r y p h a s e t h r o u g h c a p t u r i n g t h e H a l o-t a g g e d 2-A R i n c e l l l y s a t e o n t o t h e s u r f a c e o f m i c r o s p h
9、 e r e s b a s e d o n t h e s p e c i f i c r e a c t i o n b e t w e e n t h e H a l o-t a g a n d 6-c h l o r o c a p r o i c a c i d.T h e c h r o m a t o g r a p h i c m o d l e b a s e d o n t h e i mm o b i l i z e d p r o t e i n w a s c o n s t r u c t e d t h r o u g h t h e d e t e r m i
10、n a t i o n o f t h e a s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f m e t h o x a m i n e,s a l b u t a m o l a n d t o b u t e r o l a s 4.9 1 03,9.9 1 03,a n d 2.01 04 Lm o l-1.T h e c o r r e s p o n d i n g d i s s o c i a t i o n r a t e c o n s t a n t s w e r e 8.1,1 3.8,a n d 5.7 s-1 r e s p e c
11、 t i v e l y.RR ee ss uu ll tt ss U s i n g t h i s m o d e l,t h e p o t e n t i a l c o m p o u n d(X C 2 6 7)w a s d e t e r m i n e d t o h a v e a n a s s o c i a t i o n c o n s t a n t w i t h 4.41 03 Lm o l-1 a n d a d i s s o c i a t i o n r a t e c o n s t a n t w i t h 8.7 s-1,t h u s p r
12、 o v i n g X C 2 6 7 w a s a p o t e n t i a l a g o n i s t t h a t s p e c i f i c b i n d i n g t o 2-A R.CC oo nn cc ll uu ss ii oo nn W e r e a s o n e d t h a t t h e i mm o b i l i z e d 2-A R i s a b l e t o e v a l u a t e d r u g-l i k e p r o p e r t i e s o f p o t e n t i a l c o m p o
13、u n d s w i t h h i g h s p e c i f i c i t y a n d e f f i c i e n c y.K e y w o r d s:i mm o b i l i z e d p r o t e i n;2-a d r e n o r e c e p t o r;c h r o m a t o g r a p h y基金项目:陕西省西安市科技计划项目 编号:2 0 Y X Y J 0 0 0 9(2)作者简介:张建丰,女,硕士,主管药师*通信作者:延保国,男,副主任药师 创新药物研发是当前国际科技竞争的战略制高点之一,往往耗资巨大、耗时长久。在创新药物
14、研发进程中,先导化合物的成药性评价对于降低药物研发风险、提升研发成功率具有重大意义。目前,先导化合物的成药性评价方法主要包括体内的吸收、分布、代谢、排泄以及毒性评价等,存在消耗时间长、样品需求大量等不足,尤其是该评价过程无法证明化合物的作用靶点及作用方式,因此,亟需开发一种准确、快速、易于操作的先导化合物的成药性评价方法。亲和色谱1-3具有高通量和高重复性的特点,目前已经成功应用于药物 受体相互作用的分析,该方法的应用首先需要合成受体色谱固定相,WA I N E R I W等已经成功实现了多种G蛋白偶联受体(G-p r o-t e i n c o u l p e d r e c e p t o
15、 r,G P C R)色谱固定相的制备,包括2肾上腺素受体(2-a d r e n o c e p t o r,2-A R)4、烟碱型受体5、阿片样受体6、嘌呤受体7及大麻素受体8等,但以上受体色谱固定相均用物理吸附法制备,无法耐受色谱分析过程中流动相的持续洗脱,因73西北药学杂志 2 0 2 3年9月 第3 8卷 第5期h t t p:/X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t此其稳定性较差。为了解决上述问题,将卤代烷烃脱卤素酶标签(h a l o-g e n a t e d a l k a n e d e h a l o g e n a s e t a g g e d,H
16、 a l o-t a g g e d)融合至受体的非活性末端,经诱导表达获得H a l o标记的G P C R可通过生物正交反应一步固定至大孔微球表面9。用该方法制备的受体色谱固定相具有与初始受体相当的活性,可用于药物 受体相互作用分析和中药靶向活性成分筛选。在文献基础上1 0,本课题组用该方法制备了2-A R色谱固定相并将其应用于止嗽口服液活性成分的筛选,获得了能够靶向作用于2-A R的甘草次酸,经结构修饰,得到了先导化合物X C 2 6 7,本研究用非线性色谱法,以固定化2-A R为工具,对X C 2 6 7进行了初步成药性评价,以期推动2-A R靶向药物的开发。1 仪器与试药1.1 仪器
17、3 1 0 0高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司);U P D-I I-1 0 T超纯水机(四川优普超纯科技有限公司);Z H J H-1 1 1 5 B超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司);9 8-1-N电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);S S-3 2 6高压灭菌锅(TO-MY公司);1 0 3恒温培养箱(杭州艾普仪器设备有限公司);5 8 0 4 R冷冻离心机(美国F E I公司);Z Z X T-A装柱机(大 连 依 利 特 分 析 仪 器 有 限 公 司);D Y C Z-2 4 D N电泳仪(北京六一生物科技有限公司);J Y 9 2-2超声破碎仪(宁波新芝生
18、物科技股份有限公司)。1.2 试药氨基微球(知益微球有限公司);氯化钠、酵母提取物、蛋白胨和琼脂,均购自英国O x o i d公司;2-A R一抗购自北京索莱宝生物科技有限公司;六水琥珀酸钠、乳糖、甘油、二水柠檬酸钠、葡萄糖、六水氯化铁、磷酸氢二钠、七水硫酸镁和氯化铵,均购自天津市恒心化学试剂制造有限公司;甲氧那明、沙丁胺醇和妥布特罗,均购自上海阿拉丁股 份有限公司;色谱 级 甲 醇 购 自 美 国T h e r m o F i s h e r公司;其他试剂均为分析纯。2 方法2.1 2-A R受体色谱固定相的制备按照文献中的方法9,首先在大肠杆菌中表达了E.c o l i B L 2 1(D
19、 E 3)T 7/h a l o-t a g 2-A R质粒(p R e-c e i v e r-B 0 2)。该菌种自琼脂糖培养基、一级液体培养基孵育后,3 7 下在自诱导培养基中培养1 0 h,离心使菌体沉淀,向1 g大肠杆菌细胞中加入1 0 m L浓度为2 0 mm o lL-1的P B S缓冲液,超声破碎,收集上清,用蛋白质印迹法(W e s t e r n b l o t t i n g)确认受体表达。将6-氯己酸通过酰化反应修饰至微球表面,通过H a l o标签与微球表面氯离子的生物正交反应,将H a l o标记的2-A R一步固定至微球表面,获得2-A R色谱固定相。经湿法装柱,
20、即得2-A R色谱柱,见图1。2.2 色谱实验本研究的色谱实验均在高效液相色谱仪进行。流动相为磷酸盐(2 0 mm o lL-1,p H 7.4)缓冲液。检测波长:甲氧那明2 3 0 n m,沙丁胺醇2 7 6 n m,妥布特罗2 2 0 n m,X C 2 6 7 2 5 4 n m。进 样 浓 度 分 别 为0.0 5、0.1 0、0.2 0、0.5 0、1.0,2.0 mm o lL-1;进样量为5 L;进样温度为2 5。2.3 数据处理本实验用P e a k f i t 4.1 2软件中的非线性功能处理所得数据。3 结果与讨论3.1 2-A R色谱固定相的制备及表征用自诱导培养基诱导H
21、 a l o标记的2-A R的表达,超声裂解细胞后,通过离心将混合物分为上清和沉淀,用W e s t e r n b l o t t i n g验证目标受体的表达情况,见图1。如图1所示,经自诱导培养基孵育,2-A R的表达量显著提高,进一步分析可知,成功表达的受体主要存在于上清中,表明H a l o标记的2-A R溶解性良好。注:1.自诱导培养基菌体细胞;2.L B培养基菌体细胞;3.细胞裂解液上清;4.细胞裂解液沉淀。图1 H a l o标签融合2-A R诱导表达W e s t e r n b l o t t i n g图F i g.1 W e s t e r n b l o t t i
22、n g a n a l y s i s o f t h e H a l o-t a g g e d 2-A R l e v e l s通过观察甲氧那明、沙丁胺醇、妥布特罗的甲醇溶液在2-A R色谱柱上的保留行为考察该色谱系统的特异性,按照2.2项下条件进样检测,见图2。由图2可知,甲氧那明、沙丁胺醇、妥布特罗在2-A R色谱柱上的保留时间分别为4.5、4.9、7.1 m i n,远长于该色谱系统的死时间,且各药物保留时间差异较大,表明固定化2-A R色谱柱可以通过保留时间的差异来识别其配体,具有特异性。注:黑线.甲氧那明;蓝线.沙丁胺醇;红线.妥布特罗。图2 2-A R色谱柱的特异性考察F i
23、 g.2 S p e c i f i c i t y i n v e s t i g a t i o n o f i mm o b i l i z e d 2-A R83西北药学杂志 2 0 2 3年9月 第3 8卷 第5期h t t p:/X B Y Z.c b p t.c n k i.n e t3.2 3种药物与固定化2-A R的相互作用分析非线性色谱法是一种非理想条件下的色谱系统方程,适用于亲和色谱结合速率常数的测定,该理论是基于以下2个假设:(1)假设色散和柱外效应可忽略,(2)假设吸附和解离的动力学速率是色谱峰展宽的主要原因。其方程如下1 1。y=a0a31-e x p-a3a2 a
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