黄芪提取物调节IL-6_STAT3信号通路治疗马兜铃酸Ⅰ诱导肝肾损伤小鼠模型的效果观察.pdf
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1、?:黄芪提取物调节 信号通路治疗马兜铃酸诱导肝肾损伤小鼠模型的效果观察朱 哿 瑞,皮 亚 妮,王静,黄恺,彭渊,陈 高 峰,刘 成 海,陶 艳 艳上 海 中 医 药 大 学 附 属 曙 光 医 院 肝 病 研 究 所,上 海;上 海 中 医 药 大 学 中 医 药 国 际 标 准 化 研 究所,上 海;上 海 市 中 医 临 床 重 点 实 验 室,上 海;肝 肾 疾 病 病 证 教 育 部 重 点 实 验 室(上 海中 医 药 大 学),上 海通 信 作 者:陶 艳 艳,(:)摘 要:目 的 探讨黄芪提取物()改善马兜铃酸()致小鼠急性肝、肾损伤效果及其调控 信号通路的作用机制。方 法 健康
2、雄性 小鼠 只,采用简单随机分组法分为正常组()、模型组()、组()和 乙酰半胱氨酸()组()。模型组小鼠以 腹腔注射,次,持续 。正常组小鼠腹腔注射相同容积羧甲基纤维素钠。组、组 腹腔注射,次,持续 ;第 天分别按 、小鼠体质量剂量灌胃,次,持续。为阳性对照药。给药造模结束后,处死小鼠并收集血清及肝、肾组织。试剂盒检测血清、肌酐()、尿素氮()水平;染色观察肝、肾组织病理;荧光 及免疫组化分析肝、肾组织中 表达量;酶联免疫吸附实验检测肝、肾组织 、及 表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两组间比较采用 检验。结 果与正常组小鼠相比,模型组小鼠肾体比上升();与模型组相比,组
3、、和 水平显著降低(值分别为、,值均 );染色结果表明,可有效减轻 导致的肝、肾组织结构破坏和炎性细胞浸润;荧光 及免疫组化染色结果表明,可减少肝、肾组织 表达;酶联免疫吸附检测发现,可下调、及 表达。与 效应相似,两者间无明显差异。结 论 对 所致急性肝、肾损伤有保护作用,其部分作用机制可能与抑制 信号通路激活,减轻炎症反应有关。关 键 词:马兜铃酸;化学性与药物性肝损伤;急性肾损伤;转录因子;黄芪基 金 项 目:上海市科委科技支撑项目();上海市中医药三年行动计划(),(,;,;,;,):,(:):()()朱 哿 瑞,等黄 芪 提 取 物 调 节 信 号 通 路 治 疗 马 兜 铃 酸诱
4、导 肝 肾 损 伤小 鼠 模 型 的 效 果 观 察 ,();,(),(),(),();(),(),(),(),(,);,:;:();()马 兜 铃 酸 主 要 存 在 于 马 兜 铃 属 和 细 辛 属 植 物中,如 马 兜 铃、天 仙 藤、广 防 已 等。研 究证 明,马兜 铃 酸 具 有 免 疫 激 活、抗 炎、肾 毒 性、致 癌 性 和 致 突 变等 作 用。笔 者 团 队 前 期 研 究 发 现,马 兜 铃 酸(,)可 导 致 急 性 肝、肾 损 伤,其毒 理 机 制 可 能 与 氧 化 应 激、炎 症 反 应、糖 代 谢 等 途 径相 关。黄 芪 是 中 医 临 床 常 用 药 亦
5、 是 补 气 圣 药,神 农 本草 经 记 载:“黄 芪,味 甘,性 微 温,归 肺、脾、肝、肾 经”,可 补 益 元 气 而 脱 毒,治 一 切 气 衰 血 虚 之 症。黄 芪 的药 理 作 用 包 括 保 护 心、脑、肾 等 组 织,改 善 肝 脏 损 伤,提高 免 疫 功 能 等 方 面,广 泛 应 用 于 临 床。本 研 究 以 诱 导 小 鼠 急 性 肝、肾 损 伤,并 观 察 黄 芪 提 取 物(,)的 调 控 作 用 及 其 机 制。材 料 与 方 法 实 验 动 物健 康 雄 性小 鼠,周 龄,级,共只,体 质 量(),购 于 北 京 维 通 利华 生 物 有 限 公 司 实
6、验 动 物 生 产 许 可 证 号:(京)。所 有 小 鼠 均 饲 养 在 上 海 中 医 药大 学 实 验 动 物 中 心 实 验 动 物 使 用 许 可 证 号:(沪),自 由 饮 水,环 境 温 度,湿度。药 物 与 试 剂 (批 号:),购 自 上 海 诗 丹 德标 准 技 术 服 务 有 限 公 司,纯 度。冰 箱 存 放 备用。委 托 上 海 现 代 制 药 股 份 有 限 公 司 代 加 工 制 成,具体 方 法 如 下:黄 芪 ,以乙 醇 提 取次,每次 回 流。提 取 液 组 合、过 滤、减 压 浓 缩、冻 干,并采 用 中 药 指 纹 图 谱 进 行 质 量 控 制,其 主
7、 要 活 性 物 质 为黄 芪 总 皂 苷,其 中 毛 蕊 异 黄 酮 苷 含 量 为 、黄 芪 甲 苷 含 量 为 。乙 酰 半 胱 氨 酸(,)颗 粒(商 品 名:富 露 施,包,海 南 赞 绑 制 药 有 限 公 司,批 号:)。羧 甲 基 纤 维 素 钠(批 号:),购 自 国 药 集 团 化学 试 剂 有 限 公 司。临 床 肝 胆 病 杂 志 第卷 第期年月 ,(批 号:)、总提 取试 剂 盒(批 号:),购 自 上 海 生 工 生 物 工 程 股 份有 限 公 司;反 转 录 试 剂 盒(批 号:)、扩 增 试 剂 盒(批 号:)均 购 自 日 本公 司。苏 木素伊 红()染 液
8、(货 号:),购 自 南 京 建成 公 司。免 疫 组 化 抗 体:磷 酸 化(,)抗 体(批 号:)购 自 美 国公 司;免 疫 组 化 染 色 试 剂 盒(货 号:兔)、显 色 试 剂 盒(货 号:)均 购 自 武 汉 博 士 德 公 司。主 要 仪 器荧 光 倒 置 显 微 镜(日 本公 司);微 孔 板 分 光 光 度 计(美 国 公 司);实 时 荧 光 定 量仪(美 国 公 司);全 自 动 组 织 脱 水 机、石 蜡 包 埋机、石 蜡 切 片 机 均 由 德 国 莱 卡 公 司 提 供;水 浴 摊 片 机、烘 片 机 均 由 荷 兰 飞 利 浦公 司 提 供。研 究 方 法 分
9、组 与 造 模、给 药小 鼠 适 应 性 饲 养周,按 体质 量 采 用 简 单 随 机 分 组 法 分 为组:正 常 组()、模 型组()、组()和组()。模 型 组 小鼠 以 腹 腔 注 射,次,持 续 。正常 组 小 鼠 腹 腔 注 射 相 同 容 积 羧 甲 基 纤 维 素 钠。组、组 以 腹 腔 注 射,次,持 续;第天 分 别 按 、小 鼠体 质 量 剂 量 灌 胃,次,持 续。作 为 阳 性 对 照药 使 用。检 测 指 标 与 方 法 肝、肾 脏 器 指 数 测 定小 鼠 以戊 巴 比 妥钠 麻 醉 后,摘 取 肝 脏 及 双 肾,肉 眼 观 察 大 体 形 态,称重,除 以
10、小 鼠 体 质 量,计 算 肝 体 比()、肾 体 比()。肝 体 比肝 脏 质 量()体 质 量()。肾体 比肾 脏 质 量()体 质 量()。血 清 肝、肾 功 能 测 定小 鼠 麻 醉 后,用 注 射 器 从 下 腔 静 脉 抽 取 新 鲜 血 液,以,离 心,吸 取 上 层 血 清 送 至 上 海 中 医 药 大 学 附 属曙 光 医 院 检 验 科 检 测 血 清、活 性 及 肌 酐()、尿 素 氮()水 平。肝、肾 组 织染 色小 鼠 肝、肾 组 织 经中性 甲 醛 缓 冲 液 固 定,自 动 脱 水 机 脱 水,石 蜡 包 埋,切片,染 色,光 学 显 微 镜 下倍 观 察 并
11、拍 照。肝、肾 组 织的 基 因 表 达取 全 部 小鼠 肝、肾 组 织 各,加 入 试 剂 及 氯 仿 抽 提 总,应 用 试剂 盒 进 行 逆 转 录 制 备。以 为 内 参 进行 荧 光 定 量扩 增 以 检 测 各 组 肝、肾 组 织 中的 表 达 水 平。反 应 条 件:、预 变 性;变 性,退 火,个 循 环。各 组 均设个 复 孔,采 用 法 计 算 各 目 的 基 因 的 相 对表 达 量。扩 增 引 物 由 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 合成,引 物 序 列 见 表。表荧 光 定 量基 因 引 物 序 列 基 因 引 物序 列产 物 长 度()上 游 下 游
12、 上 游 下 游 肝、肾 组 织免 疫 组 化肝、肾 组 织 切片 脱 蜡 至 水,经 过 抗 原 修 复(微 波 修 复 法)后 冷 却 至 室温。滴 加 封 闭 液,加 稀 释 的 一 抗(,稀 释 比 例),冰 箱 过 夜。二 抗 孵 育,显 色。苏 木 素 复 染,二 甲 苯 透 明,中 性 树 胶 封 片,光 学 显 微 镜下倍 观 察 并 拍 照。肝、肾 组 织、及 水 平 检测取 全 部 小 鼠 肝、肾 组 织 各,加 入 生 理盐 水,匀 浆 机 获 得 组 织 匀 浆 液 后,、离 心,收 集 组 织 上 清,法 测 定、及 水 平,具 体 操 作 步 骤 遵 试 剂 盒 说
13、 明 书。统 计 学 方 法采 用 统 计 软 件 进 行 数据 分 析。计 量 资 料 以 表 示,多 组 间 比 较 采 用 单 因素 方 差 分 析,进 一 步 两 组 间 比 较 采 用 检 验。为 差 异 有 统 计 学 意 义。结 果 各 组 小 鼠 一 般 情 况正 常 组 小 鼠 反 应 灵 敏 且 动作 迅 速,被 毛 滑 润 有 光 泽,饮 食 正 常。模 型 组 小 鼠 倦怠,动 作 迟 缓,被 毛 粗 乱 无 光 泽,食 欲 明 显 下 降,染 毒 第天 模 型 组 死 亡只,占 比。组 及组 小 鼠 精 神 萎 靡,皮 毛 无 光 泽,食 欲 下 降;染毒 第天组 死
14、 亡只,占 比。对 模 型 小 鼠 体 质 量 和 脏 器 指 数 的 影 响朱 哿 瑞,等黄 芪 提 取 物 调 节 信 号 通 路 治 疗 马 兜 铃 酸诱 导 肝 肾 损 伤小 鼠 模 型 的 效 果 观 察各 组 小 鼠 活 动、饮 水 饮 食 均 不 受 限,体 质 量 变 化 如 图所 示。结 果 显 示,与 正 常 组 相 比,模 型 组 体 质 量 下 降 明 显();且 小 鼠 肝 脏 及 肾 脏 外 观 苍 白。与 模 型 组相 比,组 小 鼠 肝 脏、肾 脏 外 观 未 见 明 显 苍 白;组 肝 脏 外 观 正 常 未 见 明 显 苍 白,肾 脏 肉 眼 可 见 苍 白
15、改 变(图)。图各 组 小 鼠 体 质 量 变 化 图各 组 小 鼠 肝、肾 外 观 改 变 与 正 常 组 小 鼠 相 比,模 型 组 小 鼠 肝 体 比 有 下 降 趋势,但 差 异 无 统 计 学 意 义(),肾 体 比 显 著 升 高()。与 模 型 组 小 鼠 相 比,组 小 鼠 肝 体 比 有升 高 趋 势,但 差 异 无 统 计 学 意 义(),肾 体 比 下降();组 小 鼠 肝 体 比 升 高,肾 体 比 略 有 下降,但 差 异 均 无 统 计 学 意 义(值 均)(表)。表 对 小 鼠 模 型 脏 器 指 数 的 影 响 组 别 动 物 数(只)肝 体 比()肾 体 比(
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