黄姑鱼转录因子激活蛋白AP2α的克隆和特征分析.pdf
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1、第 44 卷 第 5 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.44,No.5 2 0 2 3 年1 0 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct.,2023 *蓝色粮仓国家重点研发计划(2018YFD0900301)、福建省自然科学基金(2022J01325)、福建省新世纪人才支持计划(B18223)和 福 建 省 海 洋 渔 业 资 源 与 生 态 环 境 重 点 实 验 室 开 放 研 究 基 金(Z822280)共 同 资 助。李 佳 程,E-mail:ljc_ 通信作者:韩 芳,教授,E-mail: 收稿日期:2022-07-26,收修改稿日期:2022-09-
2、02 DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20220726001 http:/ AP2 的克隆和特征分析.渔业科学进展,2023,44(5):104114 LI J C,GOU T,XIAO Y,LUO S,WU B L,WANG Z Y,HAN F.cDNA cloning and characterization of transcription factor activating protein AP2 from yellow drum,Nibea albiflora.Progress in Fishery Sciences,2023,44(5):104114 黄姑
3、鱼转录因子激活蛋白AP2的克隆和特征分析*李佳程 苟 涛 肖 遥 罗 帅 吴宝兰 王志勇 韩 芳(集美大学水产学院 福建省海洋渔业资源与生态环境重点实验室 农业农村部东海海水健康养殖重点实验室 福建 厦门 361021)摘要 转录因子激活蛋白 AP2 是一类能特异地结合 DNA 的核转录因子,参与动物胚胎发育的调节、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤发生以及免疫反应等多种生物过程。课题组前期通过基因组关联分析(GWAS)发现,AP2 是黄姑鱼(Nibea albiflora)抗哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的候选基因。本研究克隆了黄姑鱼转录因子 AP2,其开放阅读框(ORF)为 1 275
4、bp,编码 424 个氨基酸;所编码的AP2 蛋白质 N 端是富含脯氨酸和谷氨酰胺(P/Q-rich domain)的反式激活结构域,中间是中心基本结构(central basic region),C 端为高度保守的 helix-span-helix 基序,负责结合 DNA 和蛋白质二聚化。氨基酸序列多重比对表明,AP2 保守性强,与所检测的鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物同源性在84.63%以上。实时荧光定量PCR检测结果显示,AP2基因的mRNA广泛分布于所检测的黄姑鱼9 种组织样品中,其中血液中的表达量最高;受哈维氏弧菌攻毒感染后,肝脏、脾脏和头肾中 AP2 表达量均明显升高,特别是在肝脏中
5、,AP2 mRNA 表达水平在 24 h 时达到攻毒前的 39 倍。通过构建重组真核表达质粒 pGEFP-AP2 并转染 HEK293T 细胞进行亚细胞定位研究的结果显示,AP2分布于 HEK293T 细胞的细胞核中。进一步通过原核克隆表达获得了可溶性的 GST-AP2 融合蛋白。以上结果表明,AP2 在黄姑鱼抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。本研究对 AP2 在硬骨鱼类先天免疫中的重要功能提供了新的见解,为深入研究黄姑鱼的分子免疫机理和抗病分子育种奠定了基础。关键词 黄姑鱼;转录因子激活蛋白 AP2;哈维氏弧菌;实时荧光定量 PCR;亚细胞定位;蛋白表达 中图分类号 S917.4 文献标
6、识码 A 文章编号 2095-9869(2023)05-0104-11 转 录 因 子 激 活 蛋 白 2(transcriptional factor activating protein 2,TFAP2)又称激活蛋白 AP2,是一类分子量为 4652 kDa 核转录因子,有物种细胞类型特异性,能特异地结合 DNA,通过结合多种基因的启动子特定位点,参与基因的转录调控,在组织形态发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤发生以及免疫反应中具有重要作用(Hoffman et al,2007)。很多肿瘤的重要病理特征为特定转录因子的异常高表达,如乳腺癌中锌指蛋白转录因子高表达(吕昌新等,2013),上皮癌
7、细胞中转录因子 Snail 高表达(Wakahashi et al,第 5 期 李佳程等:黄姑鱼转录因子激活蛋白 AP2 的克隆和特征分析 105 2013)。乳腺癌 HER-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)基因的表达与转录因子 AP2 的表达量增高相关(Berlato et al,2011)。抑制转录因子AP2 的表达,可以促进乳腺癌细胞的凋亡及对放疗及化疗的敏感性(Thewes et al,2010)。HER-2 的启动子上具有 AP2 结合位点,AP2 是通过与结合癌基因 HER-2 的启动子结合并促进其转录而导致癌变(H
8、ung et al,2012),免疫组化证实人乳腺癌组织中AP2表达上调,并与 HER-2表达呈正相关(Powe et al,2009)。此外,AP2 参与乳腺癌黑色素瘤、前列腺癌和大肠癌等癌变过程(Berlato et al,2011)。黄姑鱼(Nibea albiflora)是一种具有重要经济价值的海水鱼类,在我国东南沿海地区(如浙江和福建省)广受欢迎(Liu et al,2020;Xiang et al,2020),并有较大的养殖规模。近几年来,黄姑鱼养殖遭受细菌病的严重困扰,造成很高的死亡率,特别是由哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)引起的“红头病”造成了严重的经济损失(Xia
9、ng et al,2020;Yin et al,2018)。哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性菌,在海水养殖产业中引发了多种细菌性疾病(沈桂明等,2017)。因此,本实验室用哈维氏弧菌对黄姑鱼进行了人工攻毒实验,并对实验鱼群体进行全基因组重测序挖掘单核苷酸多态性(SNP)分子标记,以攻毒后正常存活时间作为抗病力的表型值进行全基因组关联分析(GWAS),结果显示,黄姑鱼转录因子 AP2 基因位于定位区间中(Luo et al,2021)。然而,目前尚无转录因子 Ap2 基因参与鱼类抗病免疫过程的相关研究报道。本研究从黄姑鱼中克隆到 AP2 基因,分析其分子结构特征,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR
10、)技术检测其在健康组织和哈维氏弧菌感染后不同组织的表达情况,并研究 AP2 蛋白的亚细胞定位,进行蛋白质原核克隆和诱导表达,旨在阐明黄姑鱼AP2基因在黄姑鱼抵御哈维氏弧菌过程中的作用,并为深入研究黄姑鱼抗病分子机制奠定基础。1 材料与方法 1.1 实验材料 实 验 所 用 黄 姑 鱼 幼 鱼(3.281.71)g,(4.56 1.39)cm,3 月龄取自福建省宁德市金铃水产科技有限公司。攻毒前,所有幼鱼在充气海水中驯养 1 周,水温保持在(27.12.1),盐度 30,水深 1.0 m。每天在固定时间(07:00 和 18:00)饲喂 2 次市售的黄姑鱼配合饲料(天马水产科技有限公司)。攻毒实
11、验所用哈维氏弧菌菌株分离于自然发病鱼,由集美大学水产学院孙云章教授惠赠。1.2 主要试剂 Trans Zol Up Plus RNA kit 购于北京全式金生物技 术 有 限 公 司;GoScript Reverse Transcription System Protocol 购于 Promega 公司;琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒和无内毒素质粒小量提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司;ClonExpress One Step Cloning Kit 和 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;Lipo8000 转 染 试
12、 剂、GFP Rabbit Monoclonal Antibody、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG(H+L)、DAPI、BeyoColor 彩 色 预 染 蛋 白 Marker(15 120 kDa)、SDS-PAGE蛋 白 上 样 缓 冲 液(5)、BeyoBlue考马斯亮蓝快速染色液、EGFP 抗体和GST 抗体和 BeyoECL Plus 化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;胎牛血清(FBS)购于 Gibco公司;PBS(pH=7.4)缓冲液、胰蛋白酶消化液(0.25%胰酶和 0.02%EDTA)和 DMEM High Glucose 购于 BI公司;双抗(青霉素 10 0
13、00 IU/mL链霉素 10 mg/mL)购于 MP 公司;本研究所用引物均在厦门铂瑞生物科技有限公司合成。1.3 样本采集 攻毒前,采集用于组织表达分析的 6 尾正常黄姑鱼的器官或组织(包括心脏、肾脏、肝脏、皮肤、鳃、胃、脾脏、肠和血),存于 RNA 保护液中,随后80 冰箱保存,用于 RNA 提取。哈维氏弧菌感染实验采用浸泡感染的方法进行:在一个面积为 4 m2、深度为 1.5 m 的混凝土水池中,将 8 L 细菌悬浮液(109 CFU/mL)均匀泼洒到池水中,不间断充气,使其与受试幼鱼充分接触,细菌感染过程持续 3 h,之后,将所有幼鱼转移到一个新的洁净海水的水泥池中;攻毒水池用次氯酸钠
14、消毒。分别在哈维氏弧菌感染黄姑鱼后 0、6、12、24、48、72 和96 h 采集黄姑鱼各 6 尾,采集头肾、肝脏和脾,置于RNA 保护液中,随后保存在80 的冰箱中,用于RNA 提取。动物实验操作遵循集美大学水产学院动物伦理委员会的要求进行。1.4 RNA 提取及 cDNA 的合成 按照说明书步骤,使用Trans Zol Up Plus RNA kit对组织样品进行 RNA 提取并使用 GoScript Reverse Transcription System Protocol 逆转录合成 cDNA 的第一条链,黄姑鱼内参基因-actin 用于 cDNA 合成质量的检测。106 渔 业 科
15、 学 进 展 第 44 卷 1.5 黄姑鱼 AP2 开放阅读框序列的克隆和载体构建 从本实验室构建的黄姑鱼转录组数据库中获得AP2 的开放阅读框序列。根据 ClonExpress One Step Cloning Kit 设计了具有 Xho和 EcoR限制性位点的特异性引物(表 1)。PCR 的步骤:95,3 min预变性;30 个循环(95 变性 15 s,58 退火 15 s,72 延伸 1 min 30 s),72 彻底延伸 5 min。将纯化 后的 AP2 产物分别连接到 pEGFP-N1 载体和pGEX-6P-1 载体上(本实验室保存),并转化至大肠杆菌(Escherichia co
16、li)DH5 中,抗性平板筛选阳性克隆并进行菌液 PCR 鉴定,然后送厦门铂瑞生物科技有限公司测序。其中,重组质粒 pEGFP-N1-AP2 用于转染人胚胎肾细胞 293T(HEK 293T)进行亚细胞定位,pGEX-6P-1-AP2 用于原核表达蛋白质。表 1 黄姑鱼 AP2 基因克隆、RT-qPCR 及亚细胞定位所用的引物序列 Tab.1 Primers used for the cloning,RT-qPCR and subcellular localization of AP2 gene in the study 引物Primer 引物序列 Primer sequence(53)用途
17、Usage q-AP2-F GTGTCTTTATCCAAGAACAACAAC q-AP2-R GCGTCTCTGCACCTCCGCCACCTG-actin-F TTATGAAGGCTATGCCCTGCC-actin-R TGAAGGAGTAGCCACGCTCTGT RT-qPCR pEGFP-AP2-F CTACCGGACTCAGATCTCGAGATGTTAGTGCACAGTTTTTCCG pEGFP-AP2-R GTACCGTCGACTGCAGAATTCCTTTCTTGCTTCTCGTCTTTGTC 亚细胞定位 Subcellular localization pGEX-6P-1-AP2-F
18、 CCCCTGGGATCCCCGGAATTCATGTTAGTGCACAGTTTTTCCG pGEX-6P-1-AP2-R GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTTTCTTGCTTCTCGTCTTTGTC 原核表达 Prokaryotic expression 注:EcoR(GAATTC)和 Xho(CTCGAG)的酶切位点用下划线标注。Note:EcoRenzyme restriction site(GAATTC)and Xhoenzyme restriction site(CTCGAG)are underlined.1.6 生物信息学分析 使用 ExPASy-Translate(ht
19、tps:/web.expasy.org/translate/)对编码的氨基酸序列进行推导;扩增出的序列与推导的氨基酸序列经 NCBI 在线 Blast(https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与其他物种进行相似性比对;不同物种 SPHK1 氨基酸序列在 NCBI 数据库中搜索获得,并利用 ClustalW(https:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/;https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)对其进行同源性比对;黄姑鱼与其他物种的 AP2 蛋白系统发育进化树使用 MEGA v6.06 的最大似然法(ML
20、)进行构建;蛋白质的理化性质,包括理论分子量、理论等电点和氨基酸组成等使用 ExPASy-ProtParam(https:/web.expasy.org/protparam/)进行分析(张志华等,2022);蛋白中的结构域、信号肽切割位点和跨膜区域,分别使用 SMART(http:/smart.embl-heidelberg.de)、SignalP(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行预测;亚细胞定位预测在 TargetP(http:/www.cbs.dtu.d
21、k/services/TargetP/)中进行;磷酸化位点预测在NetPhos(http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)中进行;使用 SWISS-MODEL(https:/swissmodel.expasy.org/)和 tFold(https:/ VMD 1.9.2(https:/www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/vmd-1.9.2)进行蛋白三级结构可视化。1.7 RT-qPCR 设计黄姑鱼 AP2 特异性引物 q-AP2-F 和q-AP2-R,选择-actin(引物为-actin-F/-actin-R,表 1)为内参基因,以稀释
22、 80 倍的 cDNA 为模板进行RT-qPCR。使用 StepOne Plus 荧光定量 PCR 仪,按照荧光定量染料 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 说明书进行,反应体系(20 L):2 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 L;正向、反向引物各 0.5 L;cDNA 模板 4 L;ddH2O 5.0 L。反应程序:95 预变性 30 s;95 变性 10 s,60 退火 30 s,72 延伸 30 s,循环 40 次;最后为熔解曲线步骤(95 15 s,60 60 s,95 15 s)。每个样品设置 3
23、个生物学重复。采用 2Ct法结合 SPSS 20.0中 的 单 因 素 方 差 分 析(one-way ANOVA)及 LSD Multiple Comparison Test 进行基因差异表达分析,P0.05 为差异显著。1.8 细胞培养及黄姑鱼 AP2 的亚细胞定位和Western blot 将构建成功的真核表达质粒 pEGFP-YdSPHK1转染至人胚胎肾细胞 293T(HEK 293T)中进行亚细胞第 5 期 李佳程等:黄姑鱼转录因子激活蛋白 AP2 的克隆和特征分析 107 定位,同时转染 pEGFP-N1 作为阴性对照。HEK 293T细胞接种到 12 孔板中,培养基为含有 10%
24、FBS 和 1%双抗的 DMEM,5%CO2,37 恒温培养 24 h 之后,使用 Lipo8000转染试剂进行转染。转染 24 h 后,收集细胞进行 Western blot 验证以检测黄姑鱼 AP2在 HEK 293T 细胞中表达。步骤如下:先用细胞裂解缓冲液裂解,制备蛋白样品,蛋白质样品通过 12%SDS-PAGE 分离,然后转移到 PVDF 膜上;将膜用含有 5%胎牛血清白蛋白的 TBST 缓冲液在室温下封闭孵育 2 h,然后转移到 GFP 一抗稀释液中 4 过夜;用 TBST 洗涤 5 次(每次 5 min),将膜与二抗稀释液一起孵育 2 h,然后用 TBST 洗涤 7 次(每次 5
25、 min)。膜用 BeyoECL Plus 化学发光试剂盒检测,用 Image Quant LAS 4000(GE Healthcare)拍照。同时,用 4%的多聚甲醛固定细胞,0.2%的Triton X-100透化细胞,最后用 0.2%的 DAPI 进行细胞核染色。使用共焦荧光显微镜 Leica TCS SP8 系统(Leica,德国)观察绿色荧光蛋白在细胞中的分布。1.9 黄姑鱼 GST-AP2 重组蛋白诱导表达和检测 将测序正确的重组质粒(pGEX-6P-1-AP2)转化至大肠杆菌 BL21(DE3)中,在含氨苄青霉素(100 g/mL)的 LB 培养基中,37、200 r/min 振荡
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