红曲霉合成莫纳克林K的研究进展.pdf
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1、第 41 卷 第 5 期2023 年 9 月食 品 科 学 技 术 学 报Journal of Food Science and TechnologyVol.41 No.5Sep.2023doi:10.12031/spxb202300377文章编号:2095鄄6002(2023)05鄄0024鄄10引用格式:张婵,程颖,秦昱晖,等.红曲霉合成莫纳克林 K 的研究进展J.食品科学技术学报,2023,41(5):24-33.ZHANG Chan,CHENG Ying,QIN Yuhui,et al.Research progress of monacolin K synthesis in Mona
2、scusJ.Journal ofFood Science and Technology,2023,41(5):24-33.红曲霉合成莫纳克林 K 的研究进展张摇 婵1,2,摇 程摇 颖1,摇 秦昱晖1,摇 王海蛟1,摇 王聪聪1,摇 赵宇飞1,摇王摇 蓓1,2,摇 王成涛1,2(1.北京工商大学 食品与健康学院,北京摇 100048;2.北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京摇 100048)摘摇 要:红曲霉是一种药食两用丝状真菌,广泛应用于食品、医药、生物催化等领域。莫纳克林 K是红曲霉主要代谢功能活性产物,具有降脂、抗疲劳、抗菌、抗癌和保护神经等生物活性,是公认的降低胆固醇的理想药物。研究
3、对比了红曲霉与土曲霉合成莫纳克林 K 基因簇的不同,阐述了红曲霉产莫纳克林 K 的合成途径;对莫纳克林 K 在医药和保健食品、饲料等领域中应用的情况和潜力进行了归纳和展望。由于天然红曲霉发酵产功能性物质过程中,伴随产生的真菌毒素桔霉素,对肾脏、肝脏、心脏和生殖系统有毒性影响,使红曲霉工业化发展受到限制。提高红曲霉的莫纳克林 K产量,并降低桔霉素的产生,是解决功能红曲发展问题的重要途径。因此,从诱变育种、构建工程菌株、优化培养基、控制环境因子等方面总结了优选红曲霉高产莫纳克林 K 并避免桔霉素积累的技术方法。主要对红曲霉产莫纳克林 K 的合成途径、生物活性及应用领域、高产莫纳克林 K 的生物技术
4、方法研究现状进行总结,在此基础上分析红曲霉产莫纳克林 K 中存在的问题,并提出建议与展望,以期为新型红曲保健食品的研究与开发提供理论依据和参考。关键词:红曲霉;莫纳克林 K;抑制胆固醇;生理功能;诱变育种中图分类号:TS201郾 3摇 摇 摇 摇 摇 文献标志码:A收稿日期:20230625基金项目:国家自然科学基金资助项目(32172185;32072345);北京工商大学食品科学与工程“双一流冶学科建设培育项目开放课题(BT鄄BUYXTD202208)。Foundation:National Natural Science Foundation of China(32172185;3207
5、2345);Open Project of“Double First鄄Class冶 Discipline Constructionand Cultivation Program of Food Science and Engineering of Beijing Technology and Business University(BTBUYXTD202208).第一作者:张摇 婵,女,教授,博士,主要从事食品生物技术方面的研究。摇 摇 红曲霉(Monascus)又称红曲菌1,是一种典型的丝状真菌,是我国重要的药食两用微生物资源之一,其发酵产品红曲在我国及东南亚地区有上千年的应用历史,是我国传
6、统的特色出口产品之一。红曲霉产生多种有益活性物质,广泛应用于食品发酵、食品防腐、食品添加剂和中药等领域2。对于红曲霉的相关研究也一直受到广泛关注,特别是近 30 年来,关于红曲霉的基础研究发展迅速,并取得了丰硕的科研成果。以天然可食用的红曲色素和降血脂的活性物质莫纳克林 K(monacolinK,MK;又称洛伐他汀)应用最为广泛3。MK 是红曲霉在发酵过程中产生的具有降低胆固醇活性的次级代谢产物,在 20 世纪 70 年代末,由日本的Endo4发现,MK 是与胆固醇合成相关的 3鄄羟基鄄3鄄甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶(3鄄hydroxy鄄3鄄methylglutaryl coenzyme
7、A reductase,HMGCR)的竞争性抑制剂,可抑制胆固醇合成过程中的关键酶羟甲基戊二酰辅酶 A(hydroxymethylglutaryl coenzyme A,HMG42-CoA)还原酶的活性,从而有效降低人体中胆固醇的合成量5。1987 年 9 月 1 日,美国默克(Merck)公司研制的胆固醇合成抑制剂 Mevacor(主要成分为 MK)得到美国食品和药品监督管理局(Food andDrug Administration,FDA)批准6,此后利用红曲霉加工合成 MK 受到研究者的关注。据中国心血管健康与疾病报告 2020,中国心血管疾病患者数量高达 3郾 3 亿,高胆固醇血症发生
8、率正以惊人的速度增长,如何有效提高红曲霉发酵MK 的产量已成为红曲发酵产业发展中必须解决的重要问题。本研究从 MK 的生物合成途径、功能、红曲产品的开发及高产 MK 的方法等方面展开论述,希望可为红曲霉广泛应用,开发绿色、安全的活性物质提供理论依据。1摇 红曲霉产 MK 的合成途径研究进展MK(分子式 C24H36O5,相对分子质量 404,熔点157 159 益)在常态下为透明白色针状晶体,易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、苯等有机溶剂,不易溶于水、正己烷、石油醚。红曲霉中 MK 以内酯式(闭环结构)和酸式(开环结构)2 种形式存在,见图 1。酸式 MK 的结构与人体内胆固醇合成途径中 HMG-
9、CoA 还原酶结构相似,是 HMG-CoA 还原酶的竞争性抑制剂,可抑制胆固醇的合成。内酯式 MK 需要被人体肝脏分泌的羟基酸酯酶转化为酸式结构,才能够发挥降胆固醇的作用7。酸式 MK 结构对HMG-CoA 还原酶抑制效果比内酯式 MK 结构的抑制效果更好。图 1摇 Monacolin K 的结构式Fig.1摇 Molecular structure of monacolin K1979 年,日本学者 Endo4从红色红曲霉菌株中分离出一种降血脂成分称为 MK;1980 年,美国研究人员 Alberts 等5发现,土曲霉(Aspergillus ter鄄reus)也能产生 MK。对于 MK 的
10、生物合成途径、相关酶及基因的研究,最早认识来源土曲霉8,现阶段在红曲霉中 MK 的生物合成途径相较于土曲霉中的研究较少9-10。土曲霉中 MK 的合成基因簇共包含 18 个基因11,而丛毛红曲霉(Monascus pi鄄losus)中 MK 的合成基因簇包含 9 个基因,这些基因与土曲霉 MK 基因簇中的对应基因高度同源12。2005 年,周礼红13根据 GenBank 中公布的相关基因设计引物(引物序列未公布),克隆得到紫色红曲霉 M34 的 monK1 基因,敲除 monK1 后,MK 合成途径被中断,即未产生 MK。2008 年,Chen 等14利用土曲霉中 lovB 基因的保守序列为探
11、针克隆一段 DNA 序列,长度共为 45 kbp,经序列分析发现,该片段为一个包含与土曲霉 MK 合成基因高度同源的基因片段 mokA鄄mokI 的 MK 合成基因簇,推测 mokA和 mokB 用于合成肽链骨架;还包括 P450 单氧酶基因(mokC),氧化还原酶基因(mokD),脱氢酶基因(mokE),转酯酶基因(mokF),HMG-CoA 还原酶基因(mokG),转录因子基因(mokH)及外排泵基因(mokI),见表 1。Chen 等14还利用基因打靶载体敲除丛毛红曲霉 BCRC38072 中的 mokA 基因,以潮霉素抗性基因标记,得到了 44 株转化体,再经DNA 杂交技术筛选得到一
12、株 mokA 基因敲除株BCRC38135,后经发酵实验证实其失去了生产 MK的能力,研究证实了 mokA 参与 MK 合成中的作用。随后,Sakai 等15敲除丛毛红曲霉中的 mokB基因,通过 HPLC 分析丛毛红曲霉的发酵产物,结果显示未检测到 MK,但检测到 MK 的前体物莫纳克林 J(monacolin J,MJ)的存在,这说明 mokB 参与洛伐他汀二酮侧链的合成。Chen 等16又利用丛毛红曲霉内源的 3鄄磷酸甘油醛脱氢酶启动子的mokH 超表达载体转化丛毛红曲霉 BCRC38072,筛选得到 3 个 p 基因多拷贝菌株。经检测发现,mokH 基因多拷贝菌株合成 MK 的能力提高
13、了 2 倍左右。而且,通过 PT-PCR 分析发现,mokH 基因多拷贝菌株中 MK 合成相关基因的表达均高于野生菌株,证实了 mokH 作为转录因子对 MK 合成的正调控作用。大量研究表明,丝状真菌次级代谢产物的合成不仅受到生物合成途径特异性调控因子的调节,还可能受到全局性调控因子的调节。研究者们发现laeA 编码的调控因子对于曲霉属的 MK 合成也具有调控作用。Bok 等17研究了构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的 laeA 基因对在其异源表达的 MK 合成基52第 41 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张摇 婵等:红曲霉合成莫纳克林 K 的研究进展
14、因的调控作用。研究表明,敲除 laeA 基因的菌株,lovC 和 lovE 表达量明显降低,MK 的产量也随之下降;而过量表达 laeA 基因的菌株 lovC 和 lovE 表达量显著提高,MK 的产量提高了 4 倍。红曲霉中也存在类似的调控因子 MplaeA。Zhang 等18研究了红曲 霉 中 MplaeA 的 两 种 mRNA(d鄄MplaeA 和 L鄄MplaeA)的选择性拼接方式,发现 MplaeA 对红曲霉MK 的合成能力具有明显的调控作用。表 1摇 红曲霉中的 MK 合成基因簇Tab.1摇 Cluster of MK synthesis genes in Monascus红曲霉中
15、 mok 基因n(内含子)n(碱基)/bpn(氨基酸残基)/bp预测功能土曲霉中同源的 Lov 基因蛋白质相似率/%mokA79 7023 075合成肽链骨架LovB76mokB68 0812 547合成肽链骨架LovF73mokC21 717524P450 单氧酶基因LovA85mokD0792263氧化还原酶基因LovG67mokE21 228360脱氢酶基因LovC81mokF21 425413转酯酶基因LovD74mokG23 3561 052HMG-CoA 还原酶基因LovA69mokH11 464455转录因子基因LovE54mokI72 148543外排泵基因LovI81摇 摇
16、目前,关于红曲霉合成 MK 的途径只是推测与土曲霉 MK 合成途径相似。MK 是由红曲霉聚酮体合成酶(polyketide synthase,PKS)调控合成的次级代谢产物9,19,在合成过程中先形成中间体,依次转化为莫纳克林 L(monacolin L,ML)、MJ,最后形成MK,基本过程如图 2。1)洛伐他汀九酮合成酶(lov鄄astatin nonaketide synthase,LNKS)催化 1 分子丙二酰辅酶 A 依次与 9 分子乙酰辅酶 A 进行缩合反应,最终生成 MK 的主体结构九酮体化合物(nona鄄ketide)二氢莫纳克林 L(dihydromonacolin L),进一
17、步经过氧化、脱水等步骤生成 monacolin L,再经单加氧酶催化发生羟基化反应生成 monacolin J;2)洛伐他 汀 二 酮 合 成 酶(lovastatin diketide synthase,LDKS)催化1 分子丙二酰辅酶 A 与2 分子乙酰辅酶A 缩合,生成甲基丁酰辅酶 A;3)在转酯酶(transes鄄terase)的作用下,甲基丁酰辅酶 A 通过酯键连接到monacolin J 上,完成 MK 的合成9-10,19-20。2摇红曲霉产 MK 的生物活性及其应用领域研究进展摇 摇 MK 具有降脂功能,可通过抑制 HMG-CoA 还原酶活性,减少内源性脂质合成和外源性脂质吸收
18、,并促进脂质运输和排泄。除此之外,有研究发现MK 还具有抗疲劳、抗菌、抗癌和保护神经等生物活图 2摇 红曲霉中 MK 合成途径Fig.2摇 MK synthetic pathway in Monascus性21-22。多数研究结果显示 MK 对肝癌、宫颈癌、肺癌等多种恶性肿瘤均具有明显的抑制作用,并与常见化疗药物具有显著的协同作用。此外,MK 具有抗病原细菌和真菌的生物活性。有研究表明,MK能够通过抑制病原真菌麦角甾醇合成基因 ERG11和 ERG3 的转录水平来抑制其生长,从而起到抗病原真菌的效果23。Shi 等24探究了 MK 对人胶质瘤 U251 细胞的潜在抗肿瘤作用及其可能的分子机制。
19、结果显示,应用 10 滋mol/L 的 MK 抑制了 U251 细胞的增殖,抑制率高达 53郾 4%。此外,MK 诱导了活性氧的产生,并激活了线粒体介导的途径,导致细胞内还原-氧化平衡的破坏。同时,MK 激活了 MAPKs 和 NF鄄资B途径,上调了 P38 活性,下调了 JNK/ERK/P65/I资B琢62食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 9 月表达,最终导致 U251 细胞凋亡。得出结论为 MK 可以通过触发 ROS 介导的氧化损伤和调节 MAPKs 和NF鄄资B 途径诱导 U251 细胞的凋亡。Zhang 等25利用 WGCN
20、A(weighted gene co鄄expression network analysis)和 CMap(connectivitymap)软件识别和验证可能对胃癌(gastric cancer,GC)患者产生积极影响的治疗化合物:组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂 丙戊酸(valproic acid,VPA)和洛伐他汀。体外实验显示VPA 和洛伐他汀对胃癌细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用。胃癌细胞系中 HDAC2 过表达,VPA和洛伐他汀均通过抑制 HDAC2 表达诱导胃癌细胞凋亡,显示洛伐他汀可能显示出治疗胃癌的潜力。Zhang 等26研究红曲米对
21、酒精性肝病(alco鄄holic liver disease,ALD)的影响作用,将 C57/B6 雄性小鼠每天灌胃 4 g/kg 体积分数为 50%乙醇,连续 8 周诱导慢性 ALD。实验组每天给予红曲米150 mg kg-1 d-1,结果显示,补充红曲米可显著减轻酒精补充小鼠的高脂血症、循环炎症因子升高、肝脏结构损伤和氧化应激。此外,红曲米显著抑制酒精诱导的肝脏 NF鄄资B 活化和细胞凋亡。最终得到红曲米主要通过减轻肝脏氧化应激和炎症反应来预防 ALD。Zou 等27研究红曲米对非酒精性脂 肪 性 肝 病(non鄄alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的保
22、护机制。采用小鼠高脂饮食喂养模型和脂多糖及棕榈酸刺激的 HepG2 细胞模型,通过检测相关基因和蛋白的表达,探索 NF鄄资B/NL鄄RP3 炎性体和 mTORC1-SREBPs 信号通路可能的分子机制。结果表明红曲米在体内和体外改善脂质积累和肝脏炎症,红曲米通过调节 mTORC1-SREB鄄Ps 及其与甘油三酯和胆固醇合成相关的靶基因改善脂质积累;还通过抑制 NF-资B/NLRP3 炎性体信号传导来抑制肝脏炎症。结论为调节 NF-资B/NL鄄RP3 炎性体和脂质合成可能有助于红曲米对高脂型诱导的 NAFLD 的改善作用。2郾 1摇 医药和保健食品领域中的应用1987 年,洛伐他汀在美国上市,成
23、为首个上市的调脂药,是他汀类调脂的代表药。红曲米是红曲霉固态发酵的产物。血脂康是一种以红曲米为主要成分的中成药,被列入中国心血管疾病一级预防指南28。Xu 等29为评价含有红曲的中成药治疗高脂血症的疗效,涉及 1 项 4 824 名受试者的 47 项随机对照试验。评估了 3 种不同的中国红曲米补充剂(最常见的是血脂康 600 mg,每日 2 次),结果显示红曲米与安慰剂相比显著降低了低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇和甘油三酯。Kandelouei 等30评估他汀类药物对心血管疾病患者的 C 反应蛋白和高敏 C反应蛋白,发现他汀类药物降低血清中的高敏 C 反应蛋白水平。Minamizuka 等31研
24、究低日剂量的红曲米对轻度血脂异常患者的动脉硬化的影响。18名没有已知心血管疾病、仅通过饮食疗法控制的低密度脂蛋白胆固醇(3郾 96 依0郾 19)mmol/L 的患者被随机分配接受含有 2 mg MK 的低剂量红曲米(200 mg/d)或单独饮食疗法8 周。结果显示红曲米组的患者表现出低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、载体蛋白 B 和血压的明显降低,而没有任何公认的不良反应。这表明低日常剂量的红曲米可以降低血脂异常患者的心血管风险。保健食品是一种具有调节身体机能,纠正身体的亚健康状态,使身体保持健康活力且对人体不产生危害性的功能性食品。覃爱红等32将红曲与芹菜膳食纤维、白藜芦醇、核桃仁等物质按一定
25、比例加入,获得食用安全,无副作用,可促进人体正常排泄,并具有降胆固醇、降血脂和降血压作用的保健食品。何晓磊等33将石榴作为原料进行红曲霉发酵获得了果醋,该果醋营养丰富,具有一定的降糖、降脂、抗氧化功能。2郾 2摇 饲料中的应用随着人们对健康饮食和心血管疾病的重视,低胆固醇的畜禽产品备受关注。红曲霉代谢产生的MK 已被作为降低胆固醇的添加剂用于家禽生产中。崔培等34在喂养红白锦鲤幼鱼时添加红曲米,结果表明饲料中添加红曲米能显著提高试验鱼的增重率、特定生长率及饲料效率(P 0郾 05),且显著降低试验鱼血糖含量及血清中谷草转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)活性(P
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