低温保存技术在生物制品中的研究进展.pdf
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1、生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 4 期 547 555Current Biotechnology ISSN 20952341进展评述进展评述Reviews低温保存技术在生物制品中的研究进展刘容麟1,王宁2,李岩异1*,张卫婷11.华北制药金坦生物技术股份有限公司,石家庄 050035;2.石家庄农业技术推广中心,石家庄 050000摘要:生物制品在储存中易发生多种物理和化学降解,因此生物制品长期保存技术对于减缓生物制品降解、保持生物活性、延长储存期限十分必要。目前,低温保存技术是生物制品长期保存最常用且有效的方法,其能极大地减少生物制品储存时,由于液态水带来的多种物理
2、降解和化学降解导致的活性降低现象。然而低温保存技术在生物制品的保存过程中仍会发生损伤,这些损伤包括冰晶损害、冰水界面吸附变性、渗透伤害等,使用合适的冷冻工艺和冷冻保护剂(cryoprotectant agents,CPAs)对减少低温保存过程带来的负面影响有重要作用。综述了低温保存技术在生物制品保存过程中的研究进展,包括低温保存的影响因素(冷冻保护剂、冷冻过程和其他影响因素)以及最新的低温保存技术,以期为生物制品在长期保存过程中克服损伤和维持活性提供参考。关键词:冷冻;低温保存;冷冻保护剂;冻融DOI:10.19586/j.20952341.2023.0045 中图分类号:TQ464 文献标志
3、码:AReasearch Progress of Cryopreservation Technology in Biological ProductsLIU Ronglin1,WANG Ning2,LI Yanyi1*,ZHANG Weiting11.North China Pharmaceutical Jintan Biotechnology Co.,Ltd,Shijiazhuang 050035,China;2.Shijiazhuang Agricultural Technology Extension Center,Shijiazhuang 050000,ChinaAbstract:Bi
4、ological products are prone to various physical and chemical degradation during storage,so long-term storage technology for biological products is necessary to slow down degradation,maintain biological activity and extend storage life.At present,low-temperature preservation technology is the most co
5、mmonly used and effective method for long-term preservation of biological products,which can greatly reduce the activity decrease resulted from various physical and chemical degradation caused by liquid water during the storage of biological products.However,there are still some damages in the prese
6、rvation process of biological products using low-temperature preservation technology,such as ice crystal damage,adsorption denaturation of ice water interface,and osmotic damage.The use of appropriate freezing processes and cryoprotectant agents(CPAs)plays an important role in reducing the negative
7、impact of low-temperature preservation process.This article reviewed the research progress of low-temperature preservation technology in the preservation of biological products,including the influencing factors of low-temperature preservation(cryoprotectants,freezing processes and other influencing
8、factors),as well as the latest low-temperature preservation technologies,in order to provide reference for overcoming damage and maintaining activity of biological products during long-term preservation.Key words:freeze;cryopreservation;cryoprotectant;freeze thawing低温保存技术是一种利用极低的温度(一般为-80/-196),通过冷冻
9、、低温保存和解冻的过程来实现对生物制品的长期储存和再使用的方法1。通过低温保存,生物制品可得到优质、有效和安全的保障,从而延长细胞、蛋白、病毒和疫苗原液等生物制品的储存期限,扩展生物制品使用收稿日期:20230404;接受日期:20230428联系方式:刘容麟 E-mail:;*通信作者 李岩异 E-mail:生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology的灵活性。然而,低温保存中仍然存在生物制品失活、降解和变性等现象(图1),因此需要选择合适的冷冻保护剂(cryoprotectant agents,CPAs)和优化低温冷冻工艺以减少生物制品长期储存过程带来的损伤2。本文
10、综述了低温保存技术的最新应用进展,以期为生物制品低温保存相关研究提供技术参考。1低温保存技术低温保存技术是利用低温条件,将体系中一切物理化学反应变得极为缓慢甚至停止为一种保存技术,常用于不稳定物质的储存。低温保存技术在生物制品中,主要是通过降低生物、组织、细胞、微生物的酶活性,减缓代谢速度,防止生物大分子物质发生降解和氧化,从而实现生物制品的长期保存2。低温保存技术可以分为一般冷冻、超低温冷冻和液氮冷冻。一般冷冻是将样品置于温度为-40 或更低的环境中,使体系的温度处于玻璃转变温度(glass transition temperature,Tg)或共晶温度(eutectic temperatu
11、re,Te)以下,适用于细胞、细菌、酵母等微生物的保存。超低温冷冻是将样品置于温度为-80 或更低的环境中,可长期保存DNA、血液等大分子物质和生物组织。液氮冷冻是将样品浸泡在液氮中保存,温度为-196,是保护珍贵生物遗传资源的最有效方法之一3-5。2低温保存技术的影响因素生物制品是指由普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的,用于人类疾病预防、治疗和诊断的产品,主要包括生物大分子、细胞和组织等。由于生物制品具有复杂度高和特异性强的特点,其生产和制备过程异常繁琐,质量控制极为严格,经济价值和社会价值非常高,所以对
12、于生物制品的保A:冷冻过程损伤;B:解冻过程损伤;C:低温储存过程损伤图1细胞及生物分子在低温保存中的损伤因素Fig.1Damage factors of cells and biomolecules during cryopreservation548刘容麟,等:低温保存技术在生物制品中的研究进展存技术提出了很高要求。目前,低温保存技术是生物制品实现长期保存最有效的手段之一,如何利用低温保存技术实现生物制品的长期保存,延长保存期限,维持其生物活性和功能完整性,是当前生物制品研究的一个重点关注领域。低温保存技术虽然可以长期有效地保持生物制品的功能和活性,但各种条件和因素均影响其保存效果,主要影
13、响因素包括冷冻保护剂、冷冻过程、冷冻速率、储存温度和解冻速率等。通过对这些影响因素的研究,可以更好地解决生物制品在长期保存中存在的问题。2.1CPAsCPAs是一种用于保护生物组织免于因冷冻而受损害(即由于冰晶形成的损害)的物质,目前被广泛应用于生物制品的低温保存中。CPAs可以分为传统型保护剂和复合型保护剂2大类,在生物制品的低温保存中发挥着重要作用。2.1.1 传统CPAs 传统CPAs分为渗透性和非渗透性2种。渗透性CPAs包括二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇和乙酰胺等,这些物质可以在细胞冷冻悬液完全凝固之前穿透细胞膜,提供细胞内的冷冻保
14、护,也可以通过极性相互作用,定位在细胞膜磷脂的极性区域,取代水分子渗透到细胞膜内。20世纪40年代,Polge等5首次报道了 10%40%甘油对精子具有冷冻保护作用,其机制主要是能够避免因冷冻引起的细胞内电解质浓度升高问题6。然而,后续研究发现有些细胞对甘油不敏感,如牛红细胞。之后,研究者又发现DMSO是一种渗透性更强的物质,对人、牛红细胞和牛精子的冰冻损伤具有明显的保护作用。Mokoena等7通过使用DMSO建立了海洋单细胞藻类的低温保存方法,保存后其存活率达到与冻存前相同的水平。Prieto-Guevara等8 研究了DMSO和甲醇(methanol,MET)作为CPAs在微藻保存中的效果
15、,发现DMSO浓度在5%时微藻的细胞损伤率最低。Nikitin等9发现甘油(90%培养基和10%的甘油)或乙二醇(90%培养基和10%乙二醇)作为CPAs,能长期储存溶血性曼氏杆菌,存活率分别为98.6%、95.7%,而不使用CPAs时,存活率仅为40.0%。Kardorff等10研究发现低温保存人间充质干细胞和人真皮成纤维细胞时,使用渗透性 CPAs如尿素和葡萄糖时,其细胞存活率与DMSO 相当。鉴于 DMSO 具有一定的细胞毒性,尿素和葡萄糖可作为替代DMSO的安全低温保护剂。腺相关病毒一直是体外和体内基因转移最常见和最通用的载体之一。腺相关病毒的生产过程难度大、周期长,其中一个关键问题是
16、纯化后病毒载体的感染能力恢复。一项研究发现缓冲液组和实验组(5%甘油和0.001%Pluronic F68)在4 储存时,病毒的滴度损失程度相似11。但是,在经过数次-80 的冷冻/解冻循环后,与缓冲液组相比,实验组的病毒感染能力最为稳定。非渗透性CPAs主要包括一些聚合材料和小分子物质,其中聚合材料主要为聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch,HES)、聚乙二醇、葡聚糖等,小分子物质主要为蔗糖、海藻糖、明胶等。这些物质可以和细胞外的自由水分子结合,减少冷冻过程中细胞外冰晶的形成,但不能防止细胞内冰晶的形成,因此在细胞冷冻保存中,不能单独使用非渗透性CPAs,需与渗
17、透性CPAs结合共同使用,通过稀释溶质效应,改变溶液粘度提高保护效果12。Marton等13使用1%大分子聚合物聚乙二醇(poly ethylene glycol,PEG)作为保护剂进行冷冻时,噬菌斑形成单位回收率接近100%。通过冷冻和解冻的实验数据表明,在改变聚乙烯醇骨架结构后,无规则聚乙烯醇比有规则聚乙烯醇表现出更明显的冰重结晶抑制(ice recrystallization inhibition,IRI),聚脯氨酸也具有冰晶抑制活性,可保护生物体免受冰冻损伤14(表1)。2.1.2 复合型CPAs 为了平衡渗透性CPAs毒性和保存效率之间的矛盾,有效的策略是将渗透性CPAs与非渗透性C
18、PAs两者相结合,即形成复合型CPAs。通过降低渗透性CPAs的浓度,减少毒性,利用非渗透性CPAs减少体系冰晶的形成,实现细胞更好的保存。Boafo等26研究发现不同类型的低温保护剂具有不同的作用机制,而复合型CPAs对脂质体的低温储存效果更好。Fujita等15尝试探索不含 DMSO的低温保存液冷冻人脂肪源间充质基质细胞,结果表明,在乳酸林格氏溶液中加入3%海藻糖、5%右旋糖酐和2.5%5.0%丙二醇,可以较好地恢复冻融后的人脂肪源性间充质基质的细胞活性,这在细胞治疗中具有很好的前景。Guo等27发现复合型CPAs在-80 和-196 均可以显著提高法氏诺卡氏菌和鼠疫耶尔森氏菌疫苗株的存活
19、率。法氏诺卡氏菌保存最佳复合CPAs为0.292 mol L-1蔗糖、0.62 mol L-1549生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology左旋肉碱和2.82 mol L-1甘油,鼠疫耶尔森氏菌疫苗株保存的最佳复合CPAs为左旋肉碱0.62 mol L-1、甘油8.46 mol L-1、蔗糖0.292 mol L-1。Xin等28研究发现,通过使用甘油和海藻糖等组成的复合型冷冻保护剂进行冷冻保存时,可以有效保护DNA折纸纳米结构免受冻结损伤,并不会对其形态产生不良影响,为DNA折纸纳米结构在低温下长期保存提供了基础。2.1.3 新型CPAs CPAs的研究和应用有着
20、更广阔的前景,随着现代科技的不断发展,CPAs种类也越来越多,并不断涌现出新型的冷冻保护剂,如抗冻(糖)蛋白、大分子聚合物等,这些新材料的应用,不断推动着低温冷冻保护技术的进步。生存在极冷环境中的生物拥有一种特殊的冷适应能力,能产生一类抵御寒冷的蛋白质。这类保护性蛋白质被称为抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)或抗冻糖蛋白(antifreeze glycoproteins,AFGPs),其具有独特的冰晶控制功能。迄今为止,在天然鱼类、昆虫、细菌等体内发现了各种各样的AFPs和AFGPs。AFPs平面与冰晶之间的优先结合导致冰表面的微曲率变平缓,从而抑制了冰晶的生长,使其
21、能够作为抑制冰再结晶的冰重结晶抑制剂(ice recrystallization inhibitors,IRI),AFGPs是迄今为止最有效的IRI29。Sreter等17研究了来自光滑鳖甲的抗冻蛋白在人胚胎肾细胞低温保存的效果,发现该抗冻蛋白与DMSO联合使用能够显著提高低温保存细胞的存活率。另外,Sun等18研究表明,在人胚胎皮肤成纤维细胞低温保存缓冲液中,添加AFGPs可显著提高细胞的存活率,与非糖基化AFPs的研究结果相符。AFGPs经半乳糖部分化学修饰后,具有额外的疏水性基团,相较未经修饰的AFGPs,显著提高了人红细胞恢复活力。此现象可能的作用机制是 AFGPs通过疏水相互作用插入
22、细胞膜中,改变了酰基链的构象,降低了膜通透性,从而提高了细胞的存活率。聚合物具有良好的物理和化学稳定性、可调性和生物相容性,已成为广泛应用的低温保护剂。它们可以有效地调节低温下的水分子运动和表1低温冷冻保护剂及特性Table 1Cryogenic protection materials and their characteristics保护剂渗透类型渗透型渗透型渗透型渗透型甲醇非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型非渗透型种类有机小分子有机小分子有机小分子有机小分子糖糖糖糖聚合物蛋白质糖蛋白蛋白质氨基酸
23、纳米材料聚合物聚合物聚合物聚合物聚合物聚合物聚合物名称甘油二甲基亚砜乙二醇丙二醇蔗糖海藻糖甘露醇葡萄糖羟乙基淀粉抗冻蛋白抗冻糖蛋白白蛋白半胱氨酸氧化石墨烯海藻酸盐聚乙二醇海藻糖基聚合物水凝胶聚乙烯醇聚脯氨酸聚(L-丙氨酸-co-L-赖氨酸)保护作用渗透保护、抑制冰晶渗透保护、抑制冰晶渗透保护、抑制冰晶渗透保护、抑制冰晶抑制胞外大冰晶、提高玻璃转化温度抑制胞外大冰晶、提高玻璃转化温度抑制胞外大冰晶、提高玻璃转化温度抑制胞外大冰晶抑制胞外大冰晶抑制胞外大冰晶、抑制冰重结晶抑制胞外大冰晶、抑制冰重结晶抑制胞外大冰晶抗氧化封装保护,快速导热包封保护包封保护包封保护包封保护生物材料、抑制胞外大冰晶抑制冰
24、重结晶、影响冰形状包封保护生物材料、抑制冰晶、抑制重结晶抑制冰重结晶、影响冰形状参考文献579151615161012171819202122222324141425550刘容麟,等:低温保存技术在生物制品中的研究进展晶体生长过程,从而起到保护生物制品活性的作用。聚合物通常具有较高的Tg。Tg值越高,其结构越稳定,越能够保持在低温环境下的形态和活性。聚乙二醇、聚乙烯醇、海藻糖聚合物以及多聚脯氨酸等是聚合物中典型的低温保护剂。Diaz-Dussan等23使用皮肤成纤维细胞、HeLa(宫颈癌)和PC3(前列腺)癌细胞系,在控制速率和超快速冷冻方案下孵育24 h,成功地保持了高水平解冻后细胞膜的完整
25、性,并通过差示扫描量热法证实了海藻糖聚合物作为CPAs具有独特的冰再结晶抑制活性。Feyzmanesh等22研究也表明使用海藻糖聚合物作为保护剂可以有效保存人类精子。使用DMSO和乙二醇等小分子时,需要较高浓度,而这些分子在化学和遗传学上对细胞有毒害作用,因此在临床使用中受到限制。Qin等30研究表明冻存液中使用L-脯氨酸低聚物后,DMSO和乙二醇用量大大减少,同时大幅提高了卵母细胞存活率。此外,有研究表明使用圆二色光谱、动态冰成形和傅里叶变换红外光谱等方法检测对聚 L-丙氨酸-co-L-赖氨酸与聚乙烯醇,发现二者的IRI活性与其螺旋度、疏水/亲水平衡、分子量以及聚合物与冰晶相互作用的程度有关
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