皂荚与野皂荚刺中次生代谢物的差异_耿瑜欣.pdf
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1、第 58 卷 第 4 期2 0 2 2 年 4 月林业科学SCIENTIASILVAESINICAEVol.58,No.4Apr.,2 0 2 2doi:10.11707/j.1001-7488.20220409收稿日期:2021-5-14;修回日期:2021-8-13。基金项目:河北省重点研发计划项目(19226808D)。李保会为通讯作者。皂荚与野皂荚刺中次生代谢物的差异耿瑜欣1李红姣1郑建伟1张芹2于丽娜1李佳秋1李保会1(1.河北农业大学林学院保定 071000;2.河北农业大学园林与旅游学院保定 071000)摘要:【目的】皂刺中的许多次生代谢物是药用活性成分。本文旨在探究皂荚与野皂
2、荚刺的差异次生代谢物及进行差异代谢途径富集分析,为皂刺功能性化合物分离鉴定以及研究开发提供理论依据。【方法】以皂荚和野皂荚的 1 年生棘刺为材料,用 UPLC-MS/MS 检测平台和自建数据库 MWDB4.0 进行代谢组分析。【结果】1)2 个种的皂刺中共检测到 457 种次生代谢物,分为酚酸、生物碱、萜类、黄酮、木脂素、香豆素、鞣质类、其他 8 大类,酚酸和黄酮占比较大;2)野皂荚刺与皂荚刺相比,共有 213 种显著差异代谢物,其中 121 种物质在野皂荚刺中含量较高,包括 55 种酚酸,54 种黄酮,5 种木脂素和香豆素,4 种生物碱,2 种萜类,1 种其他;92 种物质在皂荚刺中含量较高
3、,包括 21 种酚酸,19 种黄酮,14 种鞣质,14 种生物碱,8 种木脂素和香豆素,16 种其他。3)皂荚刺中特有的代谢物有 22 种,异牡荆素-2-O-鼠李糖苷、N,N-二阿魏酰腐胺、香叶木素-8-C-(2-O-鼠李糖基)葡萄糖苷、紫檀芪、原花青素 C2 相对含量较高,野皂荚刺中特有的代谢物有 27 种,松柏苷、5-O-咖啡酰莽草酸、槲皮素-3-O-(2-对香豆酰)葡萄糖苷的相对含量较高。4)差异代谢物的代谢途径分析表明“茋类、二芳基庚烷类和姜酚的生物合成”途径中显著差异代谢物富集显著,苯丙烷生物合成和类黄酮代谢的差异代谢物富集较多。【结论】皂荚和野皂荚刺中共检测到 457 种次生代谢物
4、;差异代谢物质主要是黄酮和酚酸类;茋类、二芳基庚烷类和姜酚的生物合成的差异代谢物显著富集(P0.05),苯丙烷生物合成和黄酮类生物合成的差异代谢物富集较多。关键词:皂荚;野皂荚;皂刺;代谢组;差异代谢物;通路富集分析中图分类号:S793.9文献标识码:A文章编号:1001-7488(2022)04-0082-13Difference of Secondary Metabolites in Spines of Gleditsia sinensis and Gleditsia microphyllaGeng Yuxin1Li Hongjiao1Zheng Jianwei1Zhang Qin2Yu
5、Lina1Li Jiaqiu1Li Baohui1(1.School of Forestry,Agricultural University of HebeiBaoding 071000;2.School of Landscape Architecture and Tourism,Agricultural University of HebeiBaoding 071000)Abstract:【Objective】Many secondary metabolites in spina gleditsiae are medicinal active ingredients.This article
6、 aims to investigate the differential secondary metabolites in spines of Gleditsia sinensis and Gleditsia microphylla,and analyze the enrichment of the differential metabolic pathway,so as to provide a theoretical basis for the separation and identification of functional compounds from spina gledits
7、iae and for the research and development of functional compounds.【Method】The 1-year-old spines of G.sinensis and G.microphylla were used as materials,the UPLC-MS/MS detection platform was used to determine secondary metabolites,and self-built database MWDB4.0 was used for metabonomic analysis.【Resul
8、ts】1)A total of 457 secondary metabolites were detected in the two species of spina gleditsiae,which were divided into 8 categories:phenolic acids,alkaloids,terpenes,flavonoids,lignans,coumarins,tannins,and others.Among them,phenolic acids and flavonoids accounted for a relatively large proportion;2
9、)There were significant differences in 213 metabolites in the spines between G.sinensis and G.Microphylla,of which the contents of 121 substances were higher in G.microphylla spines,including 55 phenolic acids and 54 flavonoids,5 kinds of lignans and coumarins,4 alkaloids,2 terpenes,and 1 other subs
10、tance;The contents of 92 substances in G.microphylla were lower,including 21 phenolic acids,19 flavonoids,14 tannins,14 alkaloids,8 kinds of lignans and coumarins,16 others.3)There were 22 kinds of unique metabolites in G.sinensis spines,of which isovitexin-2-O-rhamnoside,N,N-Diferuloylputrescine,di
11、osmetin-8-C-(2-O-rhamnosyl)glucoside,pterostilbene,and procyanidin C2 had relatively higher 第 4 期耿瑜欣等:皂荚与野皂荚刺中次生代谢物的差异content.There were 27 unique metabolites in G.microphylla spines,of which the relative content of coniferin,5-O-Caffeoylshikimic acid,and quercetin-3-O-(2-p-Coumaroyl)glucoside was r
12、elatively higher.4)Metabolic pathway analysis of differential metabolites showed that the significantly differential metabolites in the pathways of“stilbene,diarylheptanes and gingerol biosynthesis”were significantly enriched,and the differential metabolites of phenylpropane biosynthesis and flavono
13、id metabolism were more enriched.【Conclusion】There are 457 secondary metabolites detected in G.sinensis spines and G.microphylla spines.The differential metabolites are mainly concentrated in flavonoids and phenolic acids.The stilbenoid,diarylheptanoid and gingerol biosynthesis are significantly enr
14、iched in differential metabolites(P 0.05),and the metabolites of phenylpropanoid biosynthesis and flavonoid biosynthesis are more enriched.Key words:Gleditsia sinensis;Gleditsia microphylla;spina gleditsiae;metabolome;differential metabolites;pathway enrichment analysis皂荚属(Gleditsia)是双子叶植物纲、蔷薇目、豆科植物
15、,约 12 种,多分布于热带和温带地区(兰彦平等,2006),中国原产 8 种,引进 1 种,分布与栽培于我国各个省区,覆盖区约占国土面积的 50%(顾万春等,2003),喜光,稍耐荫,具有较强的耐旱性,多生于山坡林中或谷地、路旁,属深根性植物,在微酸性、石灰质、轻盐碱土甚至粘土或砂土也能正常生长,寿命可达六七百年(范理璋,2008)。皂荚树的干燥棘刺,又称皂刺、皂针等,中国药典中记载:皂刺有消肿、脱毒、排脓和杀虫等功效。用于痈疽初起或脓成 不 溃;外 治 疥 癣 麻 风(国 家 药 典 委 员 会,2020),是传统的药材用料。近年来,国内外众多学者发现皂刺中含有黄酮、酚酸、香豆素、甾醇、内
16、酯、三萜皂苷等多种成分,具有抗氧化(宋忠兴等,2019)、抗菌(Li et al.,2016)、抗癌(Park et al.,2014)、提高免疫力等作用,因此皂刺在临床上应用非常广泛(张妍等,2017;刘伟杰,2013),且皂刺的萜类化合物在工业上也发挥着重要作用(Jiang et al.,2007)。因其综合利用价值高,供需不平衡,导致皂荚树种植面积迅速扩大,但由于过分关注前期效益,皂荚栽培过程中出现种类杂乱、低产量、低质量等问题,影响了皂荚产业的发展和效益的提升。代谢组学用于特定时期生物体内所有代谢物的定性和定量分析,研究对象多为相对分子质量小于1000 的小分子物质(杨军等,2005)
17、。植物代谢组学分析的对象包括初级代谢产物和次级代谢产物。前者主要包括碳水化合物、氨基酸、普通脂肪酸、核酸等,是 维 持 植 物 生 长 和 生 命 活 动 的 必 需 物 质(Bourgaud et al.,2001),后者的产生受发育程度、组织分化和影响生物合成基因表达的外界刺激因素的控制(邱立友等,2010),它的产生和分布通常与物种、器 官、组 织 和 生 长 阶 段 有 关(Vinale et al.,2010)。许多植物的活性药用成分都是其中的次生代谢物,并且在人工种植条件下,产量有赖于初级代谢产物的积累,品质取决于次生代谢产物的积累。植物次生代谢的过程是保证药用成分质量和有效性的基
18、础(苏文华等,2005)。近年来,众多学者利用代谢组学的方法研究苦荞(Fagopyrum tataricum)(Li et al.,2019)、银杏(Ginkgo biloba)(Meng et al.,2019)、柑橘(Citrus reticulata)(Wang et al.,2019)等植物中代谢产物的差异。本研 究 以 皂 荚(G.sinensis)和 野 皂 荚(G.microphylla)干燥棘刺为研究对象,基于 UPLC-MS/MS 自建平台和自建数据库,检测并分析皂刺中的次生代谢物,探索和分析差异代谢物的代谢途径和代谢机制,为皂刺功能性化合物的分离鉴定以及研究开发提供理论依据
19、,进而为皂荚优良品种的开发利用和产业化效益的提升奠定理论基础。1材料及方法1.1试验材料皂荚刺粗壮,有长的分枝,多呈圆锥状,长达 16 cm(CS-1-3);野皂荚刺通常较细,1 或 2 个短分支,刺长 约 1.5 5 cm,(WS-1-3)(王 世 依 等,2016)(图 1)。皂刺采集地点为河北省保定市(382915.42N,1153439.65E),生长环境、栽培措施一致,采集时间为 2020 年 11 月,两个种分别选取 3 株长势一致的植株作为 3 个重复,均为种子繁殖,约 20 年生,随机采集其 1 年生刺,迅速用酒精擦拭干净,切成小段放入离心管后放入液氮中,后放入-80 冰箱保存
20、备用。1.2样品处理生物样品放置于冻干机(Scientz-100F)中真空冷冻干燥;利用研磨仪(MM 400,Retsch)研磨(30 38林业科学58 卷图 1皂刺取样示例Fig.1Examples of spina gleditsiae samplingHz,1.5 min)至粉末状;称取 100 mg 溶于 1.2 mL 70%的甲醇提取液中;每 30 min 涡旋 1 次,每次持续 30 s,共涡旋 6 次,样本置于 4 冰箱过夜;离心(转速 12 000 r min-1,10 min)后,吸取上清液,用微孔滤膜(0.22 m)过 滤,保 存 于 进 样 瓶 中,用 于UPLC-MS/
21、MS 分析。1.3UPLC-MS/MS 分析条件1.3.1液 相 条 件 色 谱 柱:Agilent SB-C18 1.8 m,2.1 mm100 mm;流动相:A 相为超纯水(加入0.1%的甲酸),B 相为乙腈(加入 0.1%的甲酸);洗脱梯度:0.00 min B 相比例为 5%,9.00 min 内 B 相比例线性增加到 95%,并维持在 95%1 min,10.0011.10 min,B 相比例降为 5%,并以 5%平衡至 14 min;流 速 0.35 mLmin-1;柱 温 40 ;进 样 量4 L。1.3.2质谱条件LIT 和三重四极杆(QQQ)扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪
22、(Q TRAP)的AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS 联用系统上获得的,该系 统 配 备 了 ESI Turbo 离 子 喷 雾 接 口,可 由Analyst 1.6.3 软件(AB Sciex)控制运行正负两种离子模式。ESI 源操作参数如下:离子源,涡轮喷雾;源温度 550 ;离子喷雾电压(IS)5 500 V(正离子模式)/-4 500 V(负 离 子 模 式);离 子 源 气 体I(GSI),气体 II(GSII)和帘气(CUR)分别设置为50、60 和 25.0 psi,碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ 和 LIT 模式下分别用 10 和 100 molL-1聚丙二醇
23、溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ 扫描使用 MRM 模式,并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的 DP 和 CE 优化,完成了各个 MRM 离子对的 DP 和 CE。根据每个时期内洗脱的代谢物,在每个时期监测一组特定的 MRM 离子对。1.4质控样本质控样本(QC)是 3 种皂刺的混合物,用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。仪器分析过程中,每 10 个样本插入 1 个质控样本,用来观察分析过程的重复性是否良好。1.5数据结果评估基 于 自 建 数 据 库MWDB4.0(metware database),该数据库属于自建库,物质的信息来源包括公共数据库、标品数据库和自解谱的数据,根
24、据二级谱信息进行物质定性。代谢物定量是利用三重四级 杆 质 谱 的 多 反 应 监 测 模 式(multiple reaction monitoring,MRM)分析完成。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后,对所有物质质谱峰进行峰面积积分,并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正(Fraga et al.,2010)。采用多元统计分 析,对 2 组 样 本 进 行 主 成 分 分 析(Principal component analysis,PCA)、聚 类 分 析(Hierarchical cluster analysis,HCA)、重复相关性评估、正交偏最小二乘法判别分析(OP
25、LS-DA)检测所采集的数据,结果表明这项研究中记录的数据具有良好的可重复性和可靠性。结合单变量统计分析和多元统计分析的方法,初步筛选出不同品种或组织间的差异代谢物。后结合单变量分析 P 值(P-value)或差异倍数值(fold change,FC)来筛选出显著差异代谢物。用差异倍数值、OPLS-DA 模型的 VIP 值来筛选差异代谢物,其筛选标准:VIP 1,P 1.00E+07)的有东莨菪苷、异莨菪亭、原花青素 B2、苯甲酰苹果酸、二氢山奈酚-3-O-葡萄糖苷、柠檬酸、对羟基苯甲酸、香草醛、奎宁酸、原花青素 B1、落新妇苷、异槲皮苷,含量中等(1.00E+07-1.00E+06)的有香橙
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