乌骨藤对胶原诱导性关节炎大...33_ST2信号通路的影响_祝波.pdf
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1、基础研究乌骨藤对胶原诱导性关节炎大鼠 信号通路的影响祝波,马武开,陈菲菲,杨玉涛,安阳,高雪琴,刘振昆,黄颖(贵州中医药大学 第二临床医学院,贵州 贵阳;贵州中医药大学第二附属医院 风湿免疫科,贵州 贵阳;贵州中医药大学第二附属医院 体检治未病中心,贵州 贵阳)摘 要目的 探讨乌骨藤对胶原诱导性关节炎()模型大鼠白细胞介素()生长刺激表达基因 蛋白()信号通路的影响。方法 只雌性 大鼠随机分为空白组、模型组、来氟米特和乌骨藤低、中、高剂量组,后 组建立 大鼠模型;建模成功后,除空白组和模型组外,其余各组均予相应药物剂量灌胃 周,观察各组大鼠关节炎指数();采用酶联免疫吸附法()检测白细胞介素(
2、)、白细胞介素()、白细胞介素()及 干扰素()的水平;通过荧光定量 检测膝关节滑膜组织中促生长表达基因()、跨膜型()、的 表达;用蛋白质印迹()检测大鼠滑膜组织中、蛋白表达。结果 大鼠成功建模,与模型组比较,来氟米特组、乌骨藤各剂量组大鼠血清中、及 表达降低、表达升高,膝关节滑膜组织、及蛋白表达降低,差异有统计学意义(.);与模型组比较,从治疗第 周开始,各给药组 均有不同程度下降,差异有统计学意义(.)。结论 乌骨藤可能通过调控 信号相关蛋白和细胞因子的表达而发挥对 大鼠抗炎作用。关键词乌骨藤;信号通路;大鼠模型;抗炎机制中图分类号 文献标识码 文章编号():,(,;,;,),()第 卷
3、 第 期 年 月 贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目贵州省科技计划项目(黔科合平台人才,黔科合基础 一般,黔科合基础);贵州省大学生创新创业训练计划项目(贵中医大创合字)通信作者:引用本文:祝波,马武开,陈菲菲,等 乌骨藤对胶原诱导性关节炎大鼠 信号通路的影响 贵州医科大学学报,():,(),;,;,(),();类风湿关节炎(,)是以对称性多关节滑膜炎症为特征的慢性、全身性自身免疫性疾病,疾病后期可导致软骨和骨破坏,影响关节功能,造成关节畸形,严重影响个人生活质量,导致巨大的经济负担。在我国的发病率.,女性高于男性。研究表明,与遗传因素、环境因素、炎症反应及自身免疫等因素有关,认为与辅助
4、 细胞(、及)及其相关细胞因子的异常激活有关。细胞主要参与细胞的炎症反应,并激活巨噬细胞,产生白细胞介素(,)、肿瘤坏死因子(,)和 干扰素(,);细胞激活 细胞,并产生、;细胞受转录因子维甲酸受体相关孤儿受体()调节,主要产生、和。是一种前炎性细胞因子,可通过生长刺激表达基因 蛋白(,)轴募集一系列的炎性因子,促进机体炎症的发展。当机体受到刺激时,与其受体 结合后通过相应免疫通路参与炎症、自身免疫心血管疾病的生和发展。目前,西医治疗 主要采用糖皮质激素、非甾体类抗炎药及改善病情抗风湿药等药物,中医药治疗 有其特色、临床效果显著、不良反应少及安全性高。乌骨藤具有抗炎、抗肿瘤及抗纤维化等药理作用
5、,常用于治疗风湿痹痛,但作用及机制尚未见报道,本研究通过建立胶原诱导性关节炎(,)模型大鼠,探讨乌骨藤对 大鼠 信号通路相关因子的影响。材料与方法.实验材料.实验动物 只 级 周龄健康雌性 大鼠,体质量(),购自长沙天勤生物技术有限公司,动物合格证号(湘)。所有大鼠在相同条件下喂养,自由饮食、饮水,室温 。.实验药物及试剂乌骨藤片(四川国康药业有限公司,批号)、氟米特片(苏州长征一欣凯制药有限公司,批号)、牛型胶原(美国 公司,批号),完全弗氏佐剂(美国 公司,批号 )、醋酸(国药集团化学试剂有限公司,批号),试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,批号 )、试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份
6、有限公司,批号 )、试剂盒(武汉伊莱瑞特生 物 科 技 股 份 有 限 公 司,批 号 )、试剂盒(武汉华美生物工程有限公司,批号 );小鼠单抗 (武汉博士德 生 物 工 程 有 限 公 司,批 号)、兔多抗 (批号)、兔多抗 (批号)、兔多抗 (批号)均为美国 公司产品。.实验仪器离心机(湘仪 )、电热恒温培养箱(日本 )、多功能酶标仪(,)、电 期祝波等 乌骨藤对胶原诱导性关节炎大鼠 信号通路的影响子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)。.研究方法.实验分组 只 大鼠随机分为空白组、模型组、来氟米特组及乌骨藤低、中、高剂量组,每组 只。.动物造
7、模及关节炎评分除空白组外,其余各组参照文献方法建立 大鼠动物模型。用.冰释酸 稀释 牛型胶原溶解过夜,然后加入等体积的完全氟氏佐剂中,于大鼠尾根皮下多点注射.,第 天后以同样方法再注射 次。第 天开始对大鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度进行炎症评分,评分之和用关节炎指数(,)表示,分为关节炎症诱导成功,分判定为没有关节炎症发生。.给药 各组大鼠从造模第 天开始灌胃给相应药,按人与大鼠体重换算,以等效剂量为乌骨藤中剂量、其 剂量为低剂量、倍剂量定为高剂量,乌骨藤低、中、高剂量组分别给予 、()灌胃;来氟米特组剂量为 (),空白组及模型组灌胃等体积生理盐水,每日灌胃 次,持续灌胃给药 。.实验取
8、材 取材于第 天末次灌胃后,予乌拉坦腹腔麻醉后行腹主动脉取血,离心 ,取上清液置 冰箱保存;留取双后肢膝关节滑膜组织,取部分滑膜样本(.),置入 中,捣碎匀浆,离心 取上清,冰箱中保存备用。.观察指标.一般观察动物精神、步态、被毛、活动情况、饮食及饮水量、粪便。.建模后第 天开始对大鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度进行炎症评分,采用 级评分法:分,无关节发红;分,趾关节发红;分,趾关节和足跖肿肿胀;分,踝关节、趾关节和足跖关节肿胀;分,踝关节在内的全部足爪肿胀;每个关节最高分为 分,个关节累及积分记为每只大鼠的总分,分别计算各组大鼠灌胃前及灌胃第、周时。.血清、及 的水平按试剂盒说明书操作,
9、先加入标准品和待测样品,设置空白对照,温育 ,弃去孔内液体,加入生物素化抗体工作液,温育 ,加酶结合物工作液,温育 ,洗板 次,加显色剂,避光孵育 ,加入终止液,上酶标仪检测光密度 值,每组设 个复孔,重复 次,取平均值。.大鼠膝关节滑膜组织中、蛋白表达水平 取出适量膝关节滑膜组织低温匀浆后加蛋白裂解液,在冰上裂解 ,离心 、,取上清。以 为标准,用 法对上清液进行蛋白定量。取 蛋白样品,电泳,设置恒压 转模。用封闭液()浸泡 膜,室温封闭,孵育过夜。洗膜 次,次,加入稀释好的二抗,室温摇床孵育 。再用 洗膜 次,次。发光显影,用 分析胶片灰度值。.检测大鼠膝关节滑膜组织中、基因表达水平 法提
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