响应面法优化酶解-超声双辅助双水相体系制备五味子提取物.pdf
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1、w w w h x y s w g c c o m ,V o l N o 化学与生物工程C h e m i s t r y&B i o e n g i n e e r i n g 收稿日期:作者简介:宋皓瑜(),女,黑龙江大庆人,研究方向:本草化妆品,E m a i l:q q c o m;通讯作者:张彬锋,男,河南平顶山人,博士,研究方向:中药化妆品,E m a i l:z b f h o t m a i l c o m.D O I:/j i s s n 宋皓瑜,张彬锋,MA E NGY o oJ a e 响应面法优化酶解超声双辅助双水相体系制备五味子提取物J化学与生物工程,():S ON
2、G H Y,Z HAN GBF,MA E NGYJ O p t i m i z a t i o n i ne n z y m o l y s i s u l t r a s o n i c a s s i s t e da q u e o u s t w o p h a s e s y s t e mf o r p r e p a r a t i o no fS c h i s a n d r a c h i n e n s i s(T u r c z)B a i l l e x t r a c tb yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o
3、 g yJ C h e m i s t r y&B i o e n g i n e e r i n g,():响应面法优化酶解超声双辅助双水相体系制备五味子提取物宋皓瑜,张彬锋,MA E N GY o oJ a e(乐金生活健康化妆品研发(上海)有限公司,上海 )摘要:在单因素实验的基础上,以五味子乙素得率为响应值,采用响应面法优化了酶解超声双辅助双水相体系制备五味子提取物的工艺条件,并比较了双水相体系、酶辅助双水相体系、超声辅助双水相体系及酶解超声双辅助双水相体系等方法对五味子乙素的提取效果.结果表明,酶解超声双辅助双水相体系制备五味子提取物的最佳条件为:乙醇体积分数 、硫酸铵质量分数 、超
4、声时间 m i n、液固比 (m Lg),在此条件下,五味子乙素得率为 m gg,与模型预测值(m gg)接近;酶解超声双辅助双水相体系制备的五味子乙素得率显著高于双水相体系、酶辅助双水相体系及超声辅助双水相体系,说明前处理可有效促进双水相体系对五味子乙素的富集.关键词:五味子;五味子乙素;双水相体系;响应面法中图分类号:T Q R O p t i m i z a t i o ni nE n z y m o l y s i s u l t r a s o n i c a s s i s t e dA q u e o u sT w o p h a s eS y s t e mf o rP r e
5、 p a r a t i o no fS c h i s a n d r a c h i n e n s i s(T u r c z)B a i l l E x t r a c tb yR e s p o n s eS u r f a c eM e t h o d o l o g yS O N GH a o y u,Z H A N GB i n f e n g,J A EM a e n g y o o(S h a n g h a iR&DC e n t e r,L GH o u s e h o l d&H e a l t hC a r eL t d,S h a n g h a i ,C h i
6、 n a)A b s t r a c t:T a k i n gt h ey i e l do fs c h i s a n d r i nBa sar e s p o n s ev a l u e,w eo p t i m i z e dt h ep r e p a r a t i o np r o c e s so fS c h i s a n d r a c h i n e n s i s(T u r c z)B a i l l e x t r a c tb yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g i e so nt h eb a
7、 s i so f s i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t s M o r e o v e r,w ec o m p a r e dt h ee x t r a c t i o ne f f i c i e n c yo fs c h i s a n d r i nBb ya q u e o u st w o p h a s es y s t e m,e n z y m e a s s i s t e da q u e o u s t w o p h a s es y s t e m,u l t r a s o n i c a s s i s t
8、e da q u e o u s t w o p h a s es y s t e m,a n de n z y m o l y s i s u l t r a s o n i c a s s i s t e da q u e o u s t w o p h a s es y s t e m T h er e s u l t ss h o wt h a t t h eo p t i m a lp r o c e s so fe n z y m o l y s i s u l t r a s o n i c a s s i s t e da q u e o u s t w o p h a s e
9、s y s t e mi sd e t e r m i n e da s f o l l o w s:t h ee t h a n o l v o l u m e f r a c t i o no f ,t h ea mm o n i u ms u l f a t em a s s f r a c t i o no f ,t h eu l t r a s o n i c t i m eo f m i n,a n dt h e l i q u i d s o l i dr a t i oo f (m Lg)U n d e ra b o v ec o n d i t i o n s,t h ey
10、i e l do f s c h i s a n d r i nBc a nr e a c h m gg,w h i c h i s c l o s e t o t h ep r e d i c t e dv a l u e(m gg)T h ey i e l do f s c h i s a n d r i nBb ye n z y m o l y s i s u l t r a s o n i c a s s i s t e da q u e o u s t w o p h a s es y s t e mi ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r t
11、h a nt h a tb ya q u e o u st w o p h a s es y s t e m,e n z y m e a s s i s t e da q u e o u st w o p h a s es y s t e m,a n du l t r a s o n i c a s s i s t e da q u e o u s t w o p h a s es y s t e m,i n d i c a t i n gt h a tp r e t r e a t m e n tc a ne f f e c t i v e l yp r o m o t et h ee n
12、r i c h m e n to f s c h i s a n d r i nBb yt h ea q u e o u s t w o p h a s es y s t e mK e y w o r d s:S c h i s a n d r a c h i n e n s i s(T u r c z)B a i l l;s c h i s a n d r i nB;a q u e o u s t w o p h a s es y s t e m;r e s p o n s es u r f a c e宋皓瑜,等:响应面法优化酶解超声双辅助双水相体系制备五味子提取物/年第期 m e t h
13、o d o l o g y五味子是木兰科植物五味子S c h i s a n d r a c h i n e n s i s(T u r c z)B a i l l 的干燥成熟果实,广泛分布于我国东北部、韩国以及日本,具有止咳、镇静、保肝的功效.目前,已从五味子中分离鉴定出 种化合物,其中木脂素类有 种,是五味子的主要化学组分及重要药理活性成分.五味子乙素是一种联苯环辛烯木脂素,具有保护肝脏、抑制UV B导致的自由基累积、缓解P r o p i o n i b a c t e r i u ma c n e s引发的痤疮相关炎症、减少细胞及胚胎中黑色素合成等功效 ,常被作为功效成分添加在化妆品中
14、.双水相体系是一种液液分离技术,利用不同大分子在互不相溶的两个液相间分配系数的较大差异进行分离.双水相体系两相的主要成分为水且反应条件温和,不仅有利于维持化合物结构和性质的稳定,也展现出环保、低成本、易于放大生产等优势.目前关于五味子的研究多集中在利用双水相体系结合超声技术提取五味子活性成分,而前处理过程与双水相体系相结合的研究较少.酶法具有高效、环保、易操作等特点,是有效的前处理手段,可与双水相体系相结合.鉴于此,作者采用酶解超声双辅助乙醇/硫酸铵双水相体系制备五味子提取物,在单因素实验的基础上,采用响应面法优化制备工艺,并通过比较双水相体系、酶辅助双水相体系、超声辅助双水相体系及酶解超声双
15、辅助双水相体系等方法对五味子乙素的提取效果,验证前处理对双水相体系的积极作用,拟为五味子在化妆品领域的应用提供理论基础.实验 材料、试剂与仪器五味子(批号 ),购于辽宁,经鉴定为木兰科植物五味子S c h i s a n d r ac h i n e n s i s(T u r c z)B a i l l 的干燥成熟果实.粉碎后置于阴凉干燥处,备用.五味子乙素标准品(批号R D D W ,纯度),成都瑞思芬德丹生物科技有限公司;纤维素酶(Ug);乙腈,色谱纯;无水乙醇、硫酸铵、甲醇,分析纯.A g i l e n t I n f i n i t y型高效液相色谱仪,美国A g i l e n
16、t公司;型台式离心机,上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂;U C H型加热超声波清洗器,上海泰坦科技股份有限公司;J P C型高速多功能粉碎机,永康久品工贸有限公司;HWS 型电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;S K型p H计,上海亚津电子科技有限公司;R C 型磁力搅拌机,上海久然仪器设备有限公司;ME 型电子天平,瑞士梅特勒托利多集团.酶解超声双辅助双水相体系制备五味子提取物精密称取一定量的五味子粉末于具塞锥形瓶中,加入(以五味子质量计)纤维素酶及一定量的水,调节p H值至,于 水浴h后再沸水浴 m i n;冷却至室温,加入一定量的无水乙醇及硫酸铵,置于超声波清洗器中,于、W处
17、理一定时间;反应液于 rm i n离心 m i n,分别记录上相、下相体积,收集上相.五味子乙素得率的测定 五味子乙素对照溶液的配制称取 m g五味子乙素标准品,用甲醇溶解并定容至m L,摇匀,即得 m gm L五味子乙素对照溶液.供试溶液的制备精密吸取 m L上相于 m L容量瓶中,用 乙醇定容至刻度,摇匀,经 m滤膜过滤,即得供试溶液.色谱条件P o r o s h e l lH P H C 色谱柱(mm mm,m);流动相为乙腈(A)水(B),梯度洗脱程序:m i n,A;m i n,A;m i n,A;m i n,A;m i n,A;m i n,A;二极管阵列检测器(D A D),检测
18、波长 n m;流速m Lm i n;柱温;进样量L.标准曲线的绘制移取一定体积的 m gm L五味子乙素对照溶液,用甲醇稀释至浓度分别为 gm L、gm L、gm L、gm L、gm L、gm L,按 色谱条件进样分析;以五味子乙素浓度(x)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线,拟合得线性回归方程为:y x ,R ,表明五味子乙素浓度在 gm L范围内与峰面积线性关系良好.五味子乙素得率及相比的计算取供试溶液,按 色谱条件进样分析,分别按式()、()计算五味子乙素得率及相比:五味子乙素得率cVnm ()宋皓瑜,等:响应面法优化酶解超声双辅助双水相体系制备五味子提取物/年第期 相比VV()
19、式中:c为 供 试 溶 液 中 五 味 子 乙 素 浓 度,gm L;V为上相体积,m L;n为稀释倍数;m为五味子粉末质量,g;V为下相体积,m L.五味子提取物制备工艺的优化采用单因素实验,分别考察乙醇体积分数(、)、硫酸铵质量分数(、)、超声时间(m i n、m i n、m i n、m i n、m i n)及液固比(、,m Lg,下同)对五味子乙素得率及相比的影响.在单 因 素 实 验 的 基 础 上,使 用D e s i g n E x p e r t 软件设计因素水平响应面实验,以五味子乙素得率为响应值,进一步对五味子提取物制备工艺进行优化.数据统计与分析每组实验做个平行,数据以平均
20、值标准偏差表示.使用S P S S软件进行数据显著性分析,使用O r i g i n软件绘图.结果与讨论 H P L C图谱五味子乙素对照溶液及供试溶液的H P L C图谱如图所示.24020016012080400mAU5 10 15 20 25 30 35 40t/min?5 10 15 20 25 30 35 40t/minmAU5004003002001000?()a()b图五味子乙素对照溶液(a)及供试溶液(b)的H P L C图谱F i g H P L Cs p e c t r ao f s c h i s a n d r i nBc o n t r o l s o l u t i
21、 o n(a)a n ds a m p l e s o l u t i o n(b)单因素实验结果 乙醇体积分数对五味子乙素得率及相比的影响(图)2.01.81.61.41.21.00.8?(mgg-1/)1520 25 30 35?/%?EDCBAdcbba543210?反应条件:硫酸铵质量分数、液固比、超声时间 m i n注:字母不同表示具有显著性差异(P ),下图同图乙醇体积分数对五味子乙素得率及相比的影响F i g E f f e c t o f e t h a n o l v o l u m e f r a c t i o no ny i e l do fs c h i s a n
22、d r i nBa n dp h a s e r a t i o由图可知,随着乙醇体积分数的增加,五味子乙素得率及相比均逐渐升高;当乙醇体积分数从 增至 时,五味子乙素得率从 m gg升至 m gg.这是因为,随着乙醇体积分数的增加,上相体积增加,且其中乙醇含量增加,有利于富集醇溶性的五味子乙素.但得率并非评价双水相体系功效的唯一参数,合适的相比同样重要.在制备五味子提取物时,相比过高不利于两相分离,其维持在 对成分富集及实验操作更为有利.当乙醇体积分数为 时,相比为 ,处于合理范围内,此时五味子乙素得率与乙醇体积分数为 时的得率无显著性差异(P ).因此,综合考虑五味子乙素得率、提取成本及实
23、验可操作性,选取 作为响应面实验乙醇体积分数的中心点.硫酸铵质量分数对五味子乙素得率及相比的影响(图)由图可知,随着硫酸铵质量分数的增加,五味子乙素得率先升高后保持不变,相比则逐渐下降;当硫酸铵质量分数为 时,五味子乙素得率达到最高,为 m gg,此时相比为 ,处于合理范围内.这是因为,增加硫酸铵质量分数会促进水分子在下相的聚集,使上相中乙醇含量增加,促进五味子乙素在上相聚集;当硫酸铵饱和后,继续增加其质量分数不会对体系产生影响.综合考虑五味子乙素得率及宋皓瑜,等:响应面法优化酶解超声双辅助双水相体系制备五味子提取物/年第期 2.01.81.61.41.21.00.8?mgg-1/()2022
24、 24 26 28?/%?BBAcba1.81.61.41.21.00.80.6?abABC反应条件:乙醇体积分数、液固比、超声时间 m i n图硫酸铵质量分数对五味子乙素得率及相比的影响F i g E f f e c t o fa mm o n i u ms u l f a t em a s s f r a c t i o no ny i e l do f s c h i s a n d r i nBa n dp h a s e r a t i o提取成本,选取 作为响应面实验硫酸铵质量分数的中心点.超声时间对五味子乙素得率及相比的影响(图)2.01.81.61.41.21.00.8?mgg
25、-1/()3045 60 75 90?/min?AAAcb1.81.61.41.21.00.80.6?adABd反应条件:乙醇体积分数、硫酸铵质量分数、液固比 图超声时间对五味子乙素得率及相比的影响F i g E f f e c t o fu l t r a s o n i c t i m eo ny i e l do f s c h i s a n d r i nBa n dp h a s er a t i o由图可知,随着超声时间的延长,五味子乙素得率先升高后降低,相比先稳定不变后下降;当超声时间为 m i n时,五味子乙素得率达到最高,为 m gg,此时相比为 ,处于合理范围内.这是因为
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