乌珠穆沁羊早期胚胎转录组测序分析.pdf
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1、动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e乌珠穆沁羊早期胚胎转录组测序分析收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目();内蒙古自治区科技计划项目(G G );内蒙古自治区科技重大专项(Z D );内蒙古自治区科技成果转化指导项目(C G ;G G )作者简介:苏红(),女,内蒙古赤峰人,博士,主要从事动物组织胚胎与发育生物学研究.通讯作者苏红,陈陆,李秀男,王大清,赵霏霏,张越,李勇,曹贵方(内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古自治区基础兽医学重点实验室,动物胚胎与发育工程自治区高等学校重点实验室,内蒙古呼和浩特 ;
2、内蒙古农牧科学院,内蒙古呼和浩特 )摘要:试验旨在分析乌珠穆沁羊 d胚胎和 d胚胎的差异表达基因,探究以乌珠穆沁羊为代表的蒙古绵羊的早期胚胎发育过程和分子机制.通过对乌珠穆沁羊 d胚胎和 d胚胎进行mR NA测序,共富集到 个差异表达基因,尤其显著的差异表达基因包括参与到肌动蛋白细胞骨架调控、紧密连接、AMP K信号通路、P I K A k t信号通路和MA P K信号通路的基因,如R O C K、R O C K、T J P、T J P、A D I P O R、A C A C A、P D G F R、P D P K 等,以及参与核糖体信号通路的R P L家族和R P S家族的部分基因,参与帕金
3、森病、氧化磷酸化等通路中的多个N DU F家族基因.在通路分析中,E 发育阶段突出了那些与神经、血管、胰岛细胞和胰腺发育相关的通路.而使器官和身体结构更为复杂,比如调控大脑、肝脏、心脏活动的基因,在E 发育阶段被显著富集.综合来说,在 d胚胎阶段,神经、血管以及胰岛细胞和胰腺正在快速发生;在 d胚胎阶段,心脏、大脑和肝脏正处于活跃的生理时期.关键词:乌珠穆沁羊;d胚胎;d胚胎;mR NA测序;胚胎发育中图分类号:S 文献标识码:A文章编号:()我国内蒙古地区是国内肉羊的主要养殖地,大约有 个类群,统称为蒙古羊,其中乌珠穆沁羊是主要的经济品种之一,分布在锡林郭勒草原.乌珠穆沁羊的特点是尾巴肥,具
4、有多脊椎特征.在胚胎发育过程中,复杂的组织和器官的发生需要建立在一系列精密的细胞间信号传导和内在的转录程序的基础之上,这个过程极其严格,转录过程中仅有十万分之一的出错概率,转录出错后会被酶修复或剪切掉,否则会直接影响到胎儿和成年动物的生存.对那些与器官发生相关的生物学过程的关键基因及其信号通路的了解,可以为在分子生物学的背景下研究胚胎发育过程和分子机制提供有价值的参考.有研究报告了绵羊早期胚胎(日)发育过程中的m i R NA参与的生物学过程,也有P P A R D和P P A R G对 d绵羊胚胎发育影响的报道,其他有关哺乳动物早期胚胎发育过程的报道主要是关于小鼠、人类、牛和猪等动物,但是对
5、绵羊胚胎早期发育过程的研究相对较少.基于此,通过对 d胚胎(E )和 d胚胎(E )进行mR NA测序,以获得这些发育阶段完整的转录数据,有助于进一步研究绵羊胚胎发育过程中器官发生的主要转录变化.乌珠穆沁羊E 和E 之间的差异表达基因突出了胚胎不同发育阶段的重要生理变化,以及E 向E 转变所涉及的分子机制.这种探索性和补充性的转录组学分析,有利于更透彻的分析绵羊胚胎的发育过程,进一步研究胚胎发育过程中的生理过程和分子调控机制.材料与方法材料试验用动物乌珠穆沁羊选自内蒙古自治区锡林浩特市西乌珠穆沁旗,乌珠穆沁羊 d、d胚胎由本实验室自西乌珠穆沁旗取回并保存.主要试剂T r i z o l、逆转录
6、酶,I n v i t r o g e n公司产品;琼脂糖,B i o w e s t公司产品;T A E,S o l a r b i o公司产品;镁离子打断试剂盒、Ec o l iD NAp o l y m e r a s eI、UD G酶,N E B公司产品;d UT PS o l u t i o n、T a qD NA聚合酶,T h e r m of i s h e r公司产品;R NA f a s t R NA快速提取试剂盒,上海飞捷公司产品;P r i m e S c r i p tR Tr e a g e n tK i tw i t hg D NA E r a s e r,T a
7、k a r a公司产品;C h a mQ U n i v e r s a lS Y B Rq P C Rm a s t e rm i x试剂盒,南京诺唯赞公司产品.主要仪器N a n o D r o pN D ,N a n o D r o p公司产品;B i o a n a l y z e r ,A g i l e n t公司产品;o l i g o(d T)磁珠,T h e r m oF i s h e r公司产品;P C R仪,A B I公司产品;i l l u m i n aN o v a s e qTM ,联川公司产品;C F X 实时荧光定量P C R仪,B i o R a d公司产
8、品.方法R NA提取与建库测序用T R I z o l,根据厂商提供的操作方案对总样品的R NA进行分离和纯化.然后用N a n o D r o pN D 对总R NA的量与纯度进行质控.再通过B i o a n a l y z e r 对R NA的完整性进行检测,同时通过琼脂糖电泳的方案进行验证.浓度 n g/L,R I N值,O D /O D ,t o t a lR NAg满足下游试验.使用o l i g o(d T)磁珠通过两轮的纯化对其中带有多聚腺苷酸(P o l y A)的mR NA进行特异性捕获.将捕获到的mR NA在高温条件下利用镁离子打断试剂盒进行片段化,、m i n.将片段化
9、的R NA通过逆转录酶的作用下合成c D NA.然后使用Ec o l iD N Ap o l y m e r a s e I,与R N a s eH进行双链合成,将这些D N A与R N A的复合双链转化成D N A双链,同时在二链中掺入d U T PS o l u t i o n,将双链D N A的末端补齐为平末端.再在其两端各加上个A碱基,使其能够与末端带有T碱基的接头进行连接,再利用磁珠对其片段大小进行筛选和纯化.以U D G酶消化二链,再通过P C R预变性 m i n,变性,个循环每次 s,退火到 保持 s,下延伸 s,最后延伸 保留m i n,使其形成片段大小为 b p b p的文
10、库.最后,使用I l l u m i n aN o v a s e qTM 按照 标 准 操 作 对 其 进 行 双 端 测 序,测 序 模 式 为P E .生物信 息学分析下机原始 数据格式为f a s t q,用f a s t p(h t t p s:/g i t h u b c o m/O p e n G e n e/f a s t p)软件对下机原始数据进行质控,包括去除接头、重复序列和低质量序列,参数为默认参数.用H I S AT(h t t p s:/c c b j h u e d u/s o f t w a r e/h i s a t)将测序 数 据 比 对 到 基 因 组 上(
11、O v i sa r i e s A R S U I R a m b v),得到文件格式为b a m.用S t r i n g T i e软件(h t t p s:/c c b j h u e d u/s o f t w a r e/h i s a t)对基因或转录本进行组装并用F P KM定量(F P KM t o t a l e x o n f r a g m e n t s/m a p p e dr e a d s(m i l l i o n s)e x o n l e n g t h(k B),用R包e d g e R(h t t p s:/b i o c o n d u c t o
12、r o r g/p a c k a g e s/r e l e a s e/b i o c/h t m l/e d g e R h t m l)对样本差异基因进行分析,差异倍数倍或倍,且P 为差异显著.最后用D AV I D软件(h t t p s:/d a v i d n c i f c r f g o v/)对 基 因 进 行GO和K E G G富集分析.R T q P C R用R NA f a s t 总R NA提取试剂盒从乌珠穆沁羊E 和E 中提取总R NA,用P r i m eS c r i p tR T逆转录试剂盒进行逆转录后,使用C h a mQ U n i v e r s a
13、lS Y B R q P C R m a s t e r m i x进 行R T q P C R反应.GA P DH用作内参基因,随机在富集到的上调基因和下调基因中各选择个基因进行R T q P C R反应(表).表q R T P C R引物信息T a b l eP r i m e r i n f o r m a t i o nf o rq R T P C R基因G e n e基因 I DG e n e I D上游引物()U p s t r e a mp r i m e r下游引物()D o w n s t r e a mp r i m e rGA P DH C G G C A C A G T
14、 C AA G G C A GAGAA CC A C G T A C T C A G C A C C A G C A T C A CA C A C A G C T A T G GAA G T C G G C T G T G GAA GC A T T C G T C A G GAA GA G G C G GA T GA F P G C T T G G T G G T G GA T GA GA C A T A C GT G G C T T C T G C T T C A C GA G G T TAA T GF A S N AA C G C T G T G G T G C T G GA GA T T
15、 GG T T G T C C C T G T G G T C C T T C T T C A T CG S K B A G GAA C A C C AA C AA G G GA G CT C C T G G G G T GAAA T G T C C T GI T GA G G GA C GA C T A G GA G GA G GA GAAA GAA C T T C AAA G GA C A C C A G G GAT G CN R F T T C G T C C G T T T G G T A G G T AAAAGA G C A C T G GA T G GA C A T G T AA
16、GS O X GA T C A G C A T G TA C C T C C C C GA C A T G T GAA G T C T G C T G G G GMO B B C T T C GA C C G G G T C A T T G T GAC A G G T A T G G G C G T C A T C T C AM S T G G T C C A T C C AA G G G T T C GA GAAA G C GA T G C T GA T G T G G GAA X I N GA G C G G GAGAAA T G C G T G GA TA CT G C T T G GA
17、 GA C GA T G C T G T T G T T C结果R NA测序数据从胎体样本的整个转录组中(n乌珠穆沁羊个 d胚胎和n个 d胚胎),平均产生了 万条读数/样本.经过质量控制,平均保留了 万条读数/样本.此外,平均 的读数被映射到绵羊参考基因组(O v i sa r i e sA R S U I R a m b v).序列数据以B i o p r o j e c t编号为G S E (h t t p s:/wwwn c b i n l mn i hg o v/g e o/i n f o/l i n k i n g h t m l,年 月 日发布)保存在N C B I数据动物医学进展
18、 年第 卷第期(总第 期)库的序列读取档案中.E 和E 胚胎之间的差异表达基因在E 与E 的D E G s的比较中,具有显著性差异的基因有 个,E 中下调的基因在E 中被描述为上调,在E 中有 个上调基因,在E 中有 个上调基因(图和表),图的横坐标为基因表达水平相对变化位数,纵坐标为基因差异显著性.图E 中上调基因和下调基因分布火山图F i g V o l c a n op l o to f t h ed i s t r i b u t i o no fu p a n dd o w n r e g u l a t e dg e n e so fE 功能分析通过对E 中 个上调基因进行GO富集
19、分析发现,这些基因可以被富集到 个GO功能注释中,包括 个生物学过程,占;个分子功能,占;个细胞组分,占(图 A).通过对E 中 个上调基因进行GO富集分析发现,这些基因可以被富集到 个GO功能注释中,包括 个生物学过程,占;个分子功能,占;个细胞组分,占(图 B).图中富集因子表示位于该GO的差异基因个数/位于该GO的总基因数,富集因子越大,GO富集程度越高;散点图中,点的大小代表差异基因个数,点的颜色代表富集分析的显著性,显著性小于等于 表示显著富集.GO富集分析散点图是取显著性最小的前 个GO功能注释进行绘图展示.对E 中 个上调基因进行K E G G富集分析发现,这些基因共被富集到 条
20、信号通路(图 A).其 中,肌动蛋白 细胞骨架调 控、紧密连 接、AMP K信号通路、胰腺癌、P I K A k t信号通路和MA P K信号通路等被重点关注.在E 中对 个上调基因进行K E G G富集分析发现,这些基因共被富集到 条信号通路(图 B).在这些信号通路中,心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、心肌收缩、核 糖体、产热、氧化、磷酸化等被显著富集.图中富表E 和E 中显著性最高的各 个上调基因T a b l eT o p u p r e g u l a t e dg e n e s i nE a n dt o p u p r e g u l a t e dg e n e s i nE
21、E 中显著性最高的 个上调基因T o p u p r e g u l a t e dg e n e s i nE 基因I DG e n e I D基因名称G e n en a m el o g(F C)P V a lE N S OA R G S L C A E N S OA R G HN F A E N S OA R G R N F E N S OA R G N R A E N S OA R G E N S OA R G E N S OA R G L I N A E N S OA R G HK D C E N S OA R G E N S OA R G N S OA R G S L C A E
22、 N S OA R G G R E B L E 中显著性最高的 个上调基因T o p u p r e g u l a t e dg e n e s i nE E N S OA R G I T I H E N S OA R G T NMD E N S OA R G S I E N S OA R G O GN E N S OA R G E N S OA R G E N S OA R G R O B O E N S OA R G S TMN E N S OA R G E N S OA R G E N S OA R G A P O D E N S OA R G T N F R S F 苏红等:乌珠穆沁
23、羊早期胚胎转录组测序分析AE 中前 个GO功能注释;膜;膜的组成部分;质膜;转移酶活性;顶端质膜;蛋白磷酸化;内质网;磷酸化;跨膜转运;激酶活性;A T P结合;高尔基体;蛋白激酶活性;细胞表面;细胞内信号转导;胞质溶胶;天门冬氨酸型内肽酶活性;内质网膜;基底外侧质膜;核苷酸结合BE 中前 个GO功能注释;核糖体;核糖体的结构成分;翻译;细胞内;核小体;D NA结合;染色体;大核糖体亚基;信号受体活性的调节;转录调控D NA模板化;序列特异性D NA结合;轴突发生;胚胎骨骼系统形态发生;多细胞生物发育;D NA模板转录,起始;种前/后图案规范;睫状基体;细胞因子活性;对革兰氏阴性菌的防御反应;
24、细胞外区域A T o p GOT e r mi nE ;M e m b r a n e;I n t e g r a lc o m p o n e n to fm e m b r a n e;P l a s m am e m b r a n e;T r a n s f e r a s ea c t i v i t y;A p i c a lp l a s m am e m b r a n e;P r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n;E n d o p l a s m i cr e t i c u l u m;P h o s p h o r y l a
25、 t i o n;T r a n s m e m b r a n et r a n s p o r t;K i n a s ea c t i v i t y;A T Pb i n d i n g;G o l g i a p p a r a t u s;P r o t e i nk i n a s ea c t i v i t y;C e l l s u r f a c e;I n t r a c e l l u l a rs i g n a l t r a n s d u c t i o n;C y t o s o l;A s p a r t i c t y p ee n d o p e p
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