盐、碱胁迫下高丹草苗期生理特征及转录组学分析_孔德真.pdf
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1、研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):199-207收稿日期:2022-06-22基金项目:兵团重点领域科技攻关项目(2020AB016)作者简介:孔德真,男,硕士,助理研究员,研究方向:小麦杂种优势利用;E-mail:通讯作者:张鑫,男,硕士,副研究员,研究方向:草业科学;E-mail:盐、碱胁迫下高丹草苗期生理特征及转录组学分析孔德真1 段震宇1 王刚1 张鑫1 席琳乔2(1.新疆农垦科学院作物研究所 谷物品质与遗传改良兵团重点实验室,石河子 832000;2.塔里木大学 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室,阿拉尔 843300)摘 要
2、:高丹草(Sorghum bicolor S.sudanense hybrids)具有抗旱和耐盐碱特性,逐渐成为畜牧业重要的饲料作物,明确高丹草耐盐、耐碱分子调控机制对高丹草分子辅助育种具有重要意义。本文对高丹草种子进行不同浓度的 NaCl 和 Na2CO3胁迫,统计不同浓度下发芽率变化;高丹草幼苗进行200 mmol/L的NaCl和Na2CO3胁迫处理,不同时间段对整株幼苗可溶性糖、脯氨酸(PRO)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)生理指标测定和转录组学表达分析。结果表明,相同浓度中性盐(NaCl)胁迫高丹草种子发芽率、根长均大于碱性盐(Na2CO3
3、)胁迫。随着胁迫时间延长,POD 和 CAT 在中性盐胁迫时表现出逐渐下降趋势,碱性盐胁迫时呈逐渐增加趋势;PRO、可溶性糖和 T-SOD 在中性盐胁迫表现出逐渐增大趋势,碱性盐胁迫时表现出逐渐减小趋势。转录组学分析发现,在中性盐胁迫 6、12 和 24 h 后,分别鉴定出 241 个、293 个和 149 个 DEG,碱性盐胁迫后,分别鉴定出 664 个、641 个和 728 个 DEG。GO 和 KEGG 聚类分析显示,盐和碱胁迫处理下参与氧化还原酶合成、渗透胁迫、细胞膜组分、细胞氧化解毒等相关 DEG 在高丹草苗期生长过程中应对盐碱胁迫响应发挥关键性作用,DEG 主要集中在激素信号转导、
4、光合代谢、氧化还原、糖代谢、核酸修复、苯丙烷生物合成等过程与非生物胁迫或逆境相关。盐碱胁迫条件下,高丹草幼苗应对环境刺激通过激素信号转导和氧化还原酶解毒。糖代谢和还原酶合成转运在耐盐碱品种中起到了重要作用。关键词:高丹草;盐碱胁迫;转录组;生理特性DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-0758Physiological Characteristics and Transcriptome Analysis of Sorghum bicolor S.Sudanense Seedlings Under Salt-alkali Stress KONG De-zh
5、en1 DUAN Zhen-yu1 WANG Gang1 ZHANG Xin1 XI Lin-qiao2(1.Institute of Crop Research,Xinjiang Academy of Agri-Reclamation Sciences,Key Lab of Xinjiang Production and Construction Corps for Cereal Quality Research and Genetic Improvement,Shihezi 832000;2.Tarim University,Husbandry Science and Technology
6、 Key Laboratory of Production and Construction Corps of Tarim in Xinjiang,Alar 843300)Abstract:Sorghum bicolor S.sudanense has the characteristics of drought resistance and salt-alkali tolerance,and has gradually become an important feed crop in animal husbandry.It is of great significance to clarif
7、y the molecular regulation mechanism of salt-tolerant and alkali-tolerant grass for molecular-assisted breeding.In this paper,the seeds of S.bicolor S.sudanense were treated with different concentration of NaCl and Na2CO3 stress,and the germination rates of the seeds were analyzed under different co
8、ncentrations.The seedlings were treated with 200 mmol/L NaCl and Na2CO3 stress.The physiological indexes of soluble sugar,proline(PRO),catalase(CAT),peroxidase(POD)and total superoxide dismutase(T-SOD)were determined and transcriptome expression was analyzed in different time periods.The results sho
9、wed that the germination rate and root length of S.bicolor S.sudanense under the same concentration of neutral salt stress were higher than those under alkaline salt stress.With the time prolonging,POD and CAT showed a gradually decreasing trend under neutral salt stress,but gradually increasing tre
10、nd under alkaline salt stress.PRO,soluble sugar and T-SOD increased gradually under neutral salt stress,but decreased 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6200土壤盐碱化是影响植物正常生长的主要因素之一,伴随全球气候变暖,我国干旱、半干旱地区土壤盐碱化逐渐加重,影响我国农业和畜牧业发展。盐碱土主要有中性盐和碱性盐两种类型1。常见中性盐有 NaCl 和 Na2SO4,碱性盐包括 Na2CO3和NaHCO32。盐碱可使植物产生渗
11、透胁迫、离子危害和营养亏缺,影响植物正常生长发育和形态建成、光合作用,并产生次生伤害,造成物质代谢紊乱及过氧化物积累,严重影响了作物的产量及品质3-4。高丹草(Sorghum bicolorS.sudanense)为高粱(S.bicolor)与苏丹草(S.sudanense)的杂交种,具有高粱茎粗、叶宽、产量高的特点5-6。高丹草在土壤干旱7和盐碱8逆境方面也表现出较强的优势,作为畜牧饲料具有分蘖力和再生力强、适口性好等优点9,目前作为我国畜牧业发展饲料的首选之一。因此,研究高丹草耐盐碱基因及其功能以及作用机制,对高丹草的适应性改良和抗盐碱品种的培育具有重要意义。关于高丹草幼苗在不同中性盐和碱
12、性盐混合条件下的生长变化已进行了研究,盐浓度对高丹草种子萌发影响较大。而高 pH 胁迫则主要影响其幼苗生长10。高立杰等11对高丹草种子发芽耐盐碱方面进行了研究,在盐分和温度共同作用下,随着不同中性盐浓度的提高,对种子发芽的抑制力逐渐增强,在 35下可以提高种子的发芽率。随着高通量测序技术的发展,转录组测序在牧草种质资源评价、重要性状形成机制以及优异基因资源挖掘、分子标记开发等方面已有较广泛的应用12。Ma 等13首次对 50 mmol/L NaCl 胁迫处理下的多浆旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)进行转录组测序,成功鉴定出了霸王响应盐胁迫的关键基因,为干旱地区重
13、要栽培牧草和作物品种抗逆性的遗传改良提供了丰富的遗传资源。目前关于高丹草对盐碱胁迫响应研究主要集中在单一中性盐和碱性盐及混合胁迫对种子萌发和幼苗生长的生理响应研究,对于高丹草在单一中性盐和碱性盐在生理调控方面的研究较少。本研究通过不同浓度盐碱筛选高丹草种子萌发及生长最适浓度,初步筛选得到高丹草幼苗在 2 种盐胁迫下的应激反应浓度,分别在 4 个时间点取样,利用 RNA-seq 进行转录组测序,结合数据分析及归纳,进而揭示高丹草的耐盐机制,解析高丹草在幼苗期抗盐机制,为培育高丹草抗盐品种提供理论依据和基因资源。1 材料与方法1.1 材料以普通高丹草(Sorghum bicolorS.sudane
14、nse)SX-19 为研究对象,由新疆农垦科学院畜牧研究所提供,用于模拟盐碱胁迫条件中性盐和碱性盐为分析纯 NaCl 和 Na2CO3。1.2 方法1.2.1 不同处理下种子发芽率统计 试验于 2021 年在新疆农垦科学院谷物品质与遗传改良兵团重点实验室进行。种子发芽挑选大小均一、成熟饱满的种子,采用次氯酸钠消毒处理,均匀播种于含有两层滤纸的 9 cm 培养皿中萌发,分别用灭菌 ddH2O 和浓 度 为 50、100、200、300、400、500 mmol/L 的NaCl 和 Na2CO3处理,设置 3 个生物学重复,在温度 23、光照强度 400 kcmol/(m2 s)、光周期 12 h
15、/8 h(光/暗),相对湿度 75的人工气候箱中培养 7 d统计发芽率和根长。1.2.2 幼苗培养及盐碱处理 选取籽粒饱满的种子,清水浸泡 8-10 h,种子吸胀后放入 25恒温培养箱中催芽,待胚根长出后放入双层滤纸的培养盒(40 gradually under alkaline salt stress.Transcriptome analysis showed that 241,293 and 149 DEGs were identified after 6,12 and 24 h of neutral salt stress,and 664,641 and 728 DEGs were id
16、entified under alkaline salt stress.GO and KEGG cluster analysis revealed that DEGs involved in oxidative reductase synthesis,osmotic stress,cell membrane composition,cell oxidation and detoxification played a key role in the responses to salt-alkali stress the grass in the seedling.DEG mainly focus
17、ed on hormone signal transduction,photosynthetic metabolism,redox,glucose metabolism,nucleic acid repair,phenylpropane biosynthesis and other processes related to abiotic stress or stress.Under saline-alkali stress,the grass seedlings responded to environmental stimuli through hormone signal transdu
18、ction and oxidoreductase detoxification.Glucose metabolism and reductase synthesis and transport play an important role in salt-tolerant varieties.Keywords:Sorghum bicolor S.sudanense;salt-alkali stress;transcriptome;physiological characteristics2023,39(6)201孔德真等:盐、碱胁迫下高丹草苗期生理特征及转录组学分析cm 15 cm 10 cm
19、)中,按照发芽试验进行培养,培育期间每日更换 1 次清水,连续培养 25 d,待植株长至 40 cm,选择苗情长势一致的幼苗放入更换滤纸的培养盒中,采用 ddH2O 和 200 mmol/L 的 NaCl和 Na2CO3处理,分别在 0、6、12、24 h 时,每个时间段取样 5 株,经液氮速冻,置于-80保存备用,测定生理指标和转录组分析。1.2.3 生理指标的测定 取出已经保存备用的幼苗为试验材料,总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定方法采用氮蓝四唑14;过氧化物酶(POD)的测定方法采用愈创木酚法14;过氧化氢酶(CAT)的测定方法采用紫外比色法15;脯氨酸(PRO)测定方法采用磺基水杨酸
20、法16;可溶性糖测定方法采用蒽酮比色法17。1.2.4 文库的构建及转录组测序 样品 RNA 由北京康普森生物有限公司制备。RNA 样品通过质量检测进入 Illumina HiSeq 2000 平台进行转录组测序。下机所得的原始数据(raw data)经过过滤得到纯净的数据(clear data),纯净数据在于高粱的基因组高粱基 因 组(ftp:/ftp.jgi-psf.org/pub/compgen/phyt ozome/v9.0/early_release/Sbicolor_v2.1/)进行比对得到比对数据(mapped data)。1.2.5 数据处理与分析 利用 clusterProf
21、iler R18软件实现 DEGs 的 GO 和 KEGG 集分析,P 小于 0.05为显著性富集的阈值。利用 SPSS19.0 软件对不同盐碱浓度下种子发芽率、总超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、脯氨酸、可溶性糖进行方差分析、多重比较。2 结果2.1 不同盐碱浓度对高丹草种子发芽的影响随着盐碱浓度增加,种子发芽率和根长表现出逐渐减小的趋势,碱性盐胁迫下高丹草的发芽率均小于中性盐胁迫,在 200 mmol/L 时,高丹草种子发芽率变化最大(图 1-A),说明该浓度是影响高丹草发芽率的阈值浓度。碱性盐对高丹草种子发芽后根的生长速度影响大于中性盐,随着盐碱浓度的增大,高丹草种子的芽长逐渐变短
22、,当盐碱浓度大于 200 mmol/L 时,种子表面已经变黑,逐渐失去活力(图1-B)。因此,为了确定研究高丹草幼苗生理代谢变化的适宜浓度,选用 200 mmol/L 盐碱浓度进行胁迫处理,以便了解高丹草幼苗生理代谢变化。A02040608010050100200300400500发芽率Germination rate/%盐浓度 Salt concentration/(mmolL-1)CK(Water)NaClNa2CO3B图 1 不同盐碱浓度对高丹草发芽率(A)和表型(B)的影响Fig.1 Effects of different saline and alkali concentratio
23、ns on germination rates(A)and phenotypes(B)of Sorghum bicolor S.sudanense2.2 盐碱胁迫不同时间段高丹草幼苗生理代谢 变化在盐碱胁迫不同时间段,高丹草抗逆生理代谢物发生了不同变化。如图 2-A 所示,随着胁迫时间延长,中性盐(NaCl)胁迫高丹草脯氨酸含量表现出逐渐增多的趋势,在 24 h 时达到最大,碱性盐(Na2CO3)胁迫高丹草脯氨酸含量表现出逐渐减少的趋势,在 24 h 时达到最小,在不同处理时间下,碱性盐胁迫高丹草脯氨酸含量高于中性盐胁迫,碱性盐处理脯氨酸含量下降速率大于中性盐,表明碱性盐对高丹草胁迫大于中性盐
24、胁迫。如图 2-B 所示,随着胁迫处理时间延长,中性盐(NaCl)胁迫下高丹草过氧化物酶含量表现出先增大后减小的趋势,在 6 h 时达到最大,碱性盐(Na2CO3)胁迫下高丹草过氧化物酶含量表现出先增大后减小的趋势,在12 h 时达到最大,在两种不同盐胁迫下,过氧化物酶含量表现出相反趋势。如图 2-C 所示,随着胁迫时间延长,中性盐(NaCl)胁迫下高丹草过氧化氢生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6202酶含量表现出逐渐减小的趋势,在 0 h 时最大,碱性盐(Na2CO3)胁迫下高丹草过氧化氢酶含量表现出逐渐增大的趋势,在 24 h 时达到
25、最大,在两种不同胁迫条件下,中性盐胁迫含量大于碱性盐胁迫。如图 2-D 所示,随着胁迫时间的延长,中性盐(NaCl)胁迫下高丹草可溶性糖量表现出增大趋势,但是变化率较小,在 12 h 时最大,碱性盐(Na2CO3)胁迫下高丹草可溶性糖含量表现出逐渐减少的趋势,在0 h 和 6 h 时最大,在两种不同胁迫条件下,可溶性糖在碱胁迫时含量大于盐胁迫。如图 2-E 所示,随着胁迫时间延长,中性盐(NaCl)胁迫下高丹草总过氧化物歧化酶(T-SOD)含量较 0 h 变化不大,碱性盐(Na2CO3)胁迫下总过氧化物歧化酶含量表现出逐渐减小趋势,在 0 h 时最大,两种不同盐胁迫时,总过氧化物歧化酶在碱性盐
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