线粒体DNA碱基编辑技术研究进展_宋睿嘉.pdf
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1、遗传 Hereditas(Beijing)ISSN 0253-9772,CN 11-1913/R 遗传网络首发论文遗传网络首发论文 题目:线粒体 DNA 碱基编辑技术研究进展 作者:宋睿嘉,韩露,孙海峰,沈彬 DOI:10.16288/j.yczz.23-045 收稿日期:2023-03-01 网络首发日期:2023-07-05 引用格式:宋睿嘉,韩露,孙海峰,沈彬线粒体 DNA 碱基编辑技术研究进展J/OL遗传.https:/doi.org/10.16288/j.yczz.23-045 网络首发网络首发:在编辑部工作流程中,稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶段。录用定
2、稿指内容已经确定,且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期刊特定版式(包括网络呈现版式)排版后的稿件,可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合出版管理条例和期刊出版管理规定的有关规定;学术研究成果具有创新性、科学性和先进性,符合编辑部对刊文的录用要求,不存在学术不端行为及其他侵权行为;稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、出版的技术标准,正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等。为确保录用定稿网络首发的严肃性,录用定稿一经发布,不得修改论文题
3、目、作者、机构名称和学术内容,只可基于编辑规范进行少量文字的修改。出版确认出版确认:纸质期刊编辑部通过与中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有限公司签约,在中国学术期刊(网络版)出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版,以单篇或整期出版形式,在印刷出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为中国学术期刊(网络版)是国家新闻出版广电总局批准的网络连续型出版物(ISSN 2096-4188,CN 11-6037/Z),所以签约期刊的网络版上网络首发论文视为正式出版。Hereditas(Beijing)收稿日期:2023-03-01;修回日期:20230621;基金项目:国家重点研发计划
4、项目(编号:2021YFC2700600),国家自然科学基金项目(编号:31970796)资助Supported by the National Key R&DProgram of China(No.2021YFC2700600),and the National Natural Science Foundation of China(No.31970796)作者简介:宋睿嘉,在读本科生,专业方向:临床医学。E-mail:韩露,在读硕士研究生,专业方向:生殖医学。E-mail:宋睿嘉和韩露并列第一作者。通讯作者:沈彬,博士,研究员,研究方向:生殖医学、基因编辑。E-mail:DOI:10.16
5、288/j.yczz.23-045综 述线粒体线粒体 DNADNA 碱基碱基编辑技术研究进展编辑技术研究进展宋睿嘉,韩露,孙海峰,沈彬南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室,南京 211166摘要:线粒体作为真核高等生物的能量工厂,通过有氧呼吸的方式为各项生命活动提供能量(ATP)。线粒体拥有一套独立于细胞核的基因组线粒体 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA),编码 37 个基因,其突变会导致线粒体疾病,目前已在人 mtDNA 中鉴定出了超过 100 种致病突变位点,总发病率约为 1/5000。近年来,基于 CRISPR 的碱基编辑技术已经实现了对核基因组的精确编辑,
6、然而由于 CRISPR 系统中的引导 RNA 难以通过线粒体的双层膜结构,在 mtDNA 上实现精确的碱基编辑仍具有较大的挑战性。2020 年,美国哈佛大学 David R.Liu 实验室报道了一种伯克霍尔德氏菌来源的双链 DNA 脱氨酶 DddA,将其与可编程的转录激活样效应因子(transcription activator-like effector,TALE)和尿嘧啶糖苷酶抑制剂(uracil glycosylase inhibitor,UGI)融合组装成为 DdCBEs(DddA 来源的胞嘧啶碱基编辑器),首次在 mtDNA 上实现了特异高效的 CG 到 TA的转换。本文对近几年基于
7、 DddA 的线粒体碱基编辑技术的发展进行综述,并对其未来应用前景进行展望,以期为相关领域的科研人员进一步了解、使用及优化线粒体碱基编辑技术提供参考。关键词:线粒体 DNA;碱基编辑;线粒体疾病;DdCBEAdvances in mitochondrial DNA base editing technologyRuijia Song,Lu Han,Haifeng Sun,Bin ShenState Key Laboratory of Reproductive Medicine and Offspring Health,Nanjing Medical University,Nanjing 211
8、166,ChinaAbstract:Mitochondria,the energy factories of higher eukaryotes,provide energy(ATP)for life activities throughaerobic respiration.They possess their own genome,mitochondrial DNA(mtDNA),which encodes 37 genes.Mutations inmtDNA cause mitochondrial diseases,and more than 100 pathogenic mutatio
9、ns have been identified in human mtDNA,with a total incidence rate of about 1/5000.In recent years,advances in CRISPR-based base editing technology haveenabled accurate editing of nuclear genes.However,it remains a challenge to achieve precise base editing on mtDNA due tothe difficulty of guide RNA
10、in the CRISPR system passing through the mitochondrial double-membrane.In 2020,David R.Lius group at Harvard University reported a double-stranded DNA deaminase DddA from Burkholderia cenocepacia,网络首发时间:2023-07-05 16:51:27网络首发地址:https:/ 36 卷which was fused with the programmable transcription activat
11、or-like effector(TALE)and uracil glycosylase inhibitor(UGI)to develop DddA-derived cytosine base editors(DdCBEs).Using DdCBEs,they were able to achieve specific and efficientCG to TA conversion on mtDNA for the first time.In this review,we summarize the recent progress of mitochondrial baseediting t
12、echnology based on DddA and prospect its future application prospects.The information presented may facilitateinterested researchers to grasp the principles of mitochondrial base editing,to use relevant base editors in their own studies,or to optimize mitochondrial base editors in the future.Keyword
13、s:mitochondrial DNA;base editing;mitochondrial diseases;DdCBE线粒体是真核生物重要的细胞器,不仅通过氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)进行有氧呼吸产生 ATP,而且在氨基酸生物合成、脂肪酸和类固醇代谢方面亦发挥了重要作用1,2。根据由外向内的结构可将线粒体划分为四个功能区:线粒体外膜(outer membrane,OM)、线粒体膜间隙(intermembrane space,IMS)、线粒体内膜(inner membrane,IM)和线粒体基质(matrix)。线粒体内膜又可划分为三个区域:
14、内界膜(inner boundary membrane,IBM)、嵴连接(crista junction,CJ)和嵴(cristae)3。人体几乎所有的细胞都具有线粒体(成熟红细胞除外),不同组织的细胞内线粒体数量不同,神经细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等含有的线粒体数量较多,这与其高代谢率有关。在哺乳动物细胞中,mtDNA以共价闭合的双链环状分子存在,可分为编码区和非编码区2,4,5。哺乳动物的mtDNA编码区共含有37个基因,由13个氧化磷酸化相关的蛋白质编码基因、2个rRNA基因(编码12S rRNA和16S rRNA)以及22个tRNA基因组成4,6。非编码区又称D环区(D-Loop re
15、gion)或控制区(control region),与mtDNA的复制及转录有关6。由于mtDNA缺少组蛋白保护,且其处于线粒体氧化磷酸化所产生的高活性氧环境之中,加之线粒体缺乏有效的DNA损伤修复系统,因此mtDNA极易受到氧自由基的攻击而发生突变,突变率较核基因组高1017倍2,79。由于线粒体基因组缺乏内含子,mtDNA突变很容易累及基因组内重要的功能区,当突变型mtDNA的占比例超过突变负荷的阈值时(一般为60%90%),可导致线粒体功能障碍相关性疾病的发生1,2,8。长久以来,科研人员一直探索如何对 mtDNA 突变进行模拟或者修复。由于线粒体双层膜结构缺乏高效的 DNA 和 RNA
16、 的转运系统,导致以 CRISPR 为基础的 DNA 编辑工具很难在线粒体中进行工作1012。仅以蛋白为基础的 mtDNA 编辑器可以进入线粒体(如 ZFN1319和 TALEN2024),对突变的 mtDNA 分子进行 DNA 双链切割,随后线性化的 mtDNA 被线粒体的外切酶快速降解,这一过程虽然使得突变型/野生型mtDNA 的比例发生变化,但它们不能在 mtDNA 上模拟突变或者修复突变,且无法改变同质性突变的比例10,25。线粒体碱基编辑技术的诞生打破了这一僵局,本文将对线粒体碱基编辑技术的发展进行介绍和总结。1 1DddADddA 衍生的胞嘧啶碱基编辑器(衍生的胞嘧啶碱基编辑器(D
17、ddA-derivedDddA-derived cytosinecytosine basebase editorseditors,DdCBEsDdCBEs)1 1.1.1 基于双链基于双链 DNADNA 脱氨酶脱氨酶 DddADddA 实现实现 mtDNAmtDNA 上的胞嘧啶碱基编辑上的胞嘧啶碱基编辑目前使用的核基因组碱基编辑器均基于 CRISPR/Cas 系统,其将 DNA 双链解旋,暴露出单链 DNA,再通过天然的或人工改造的脱氨酶(如胞嘧啶脱氨酶 rAPOBEC 和腺嘌呤脱氨酶 TadA)与 nCas9 融合,实现 DNA 上胞嘧啶的脱氨(C 到 dU)或腺嘌呤的脱氨(A 到 dI),
18、从而在 DNA 修复和复制过程中被识别为 C 到 T 或 A 到 G2629。2020 年,Mok 等30在伯克霍尔德氏菌中发现了一种新型的细菌间毒素 DddA,并尝试将其脱氨酶结构域 DddAtox应用于 mtDNA 的碱基编辑。DddAtox可以催化双链 DNA 上胞嘧啶(dC)的脱氨,形成尿嘧啶(dU)。为了克服全长的 DddAtox对哺乳动物细胞的毒性伤害,DddAtox被分裂为两个半体,并分别融合到线粒体靶向的 TALE 阵列中,从而确保两个半体在靶向基因区域结合在一起时才恢复催化活性。胞嘧啶脱氨后形成的 dU 会被内源性的尿嘧啶糖苷酶(UNG)切除31,将两条 TALE 分别融合
19、UGI,以阻止 dU 被切除,经过 DNA 复制或修复,最终实现了 CG 到 TA 的碱基对转换。这一套第*期作者等:标题3编辑系统被称为DddA 来源的胞嘧啶碱基编辑器(DdCBEs)(图 1,表 1)。Mok 等30通过使用不依赖CRISPR 的 DdCBEs 首次在 mtDNA 上实现了精确的碱基编辑,得到的 mtDNA 突变细胞呈现出线粒体功能受损的表型。这对于理解 mtDNA 突变与线粒体疾病表型的关系提供了重要细胞模型,为后续新型碱基编辑器的开发奠定了基础(表 1),对由 mtDNA 突变导致的线粒体疾病的研究及基因治疗具有深远意义3235。表表 1 1 线粒体碱基编辑器的编辑类型
20、和序列偏好性线粒体碱基编辑器的编辑类型和序列偏好性Table1 The editing type and motif of mitochondrial base editors线粒体碱基编辑器编辑类型序列偏好性DdCBEsCG 到 TATCmDdCBEsCG 到 TATCHiFi-DdCBEsCG 到 TATCDdCBEs(V6)CG 到 TATCDdCBEs(V11)CG 到 TAHC(H=A,C,T)TALEDsAT 到 GCNA(N=A,C,T,G)1 1.2.2 DdCBEDdCBE 在构建疾病模型中的应用在构建疾病模型中的应用为了探究 DdCBEs 是否能够实现在体 mtDNA 编辑
21、,构建模拟人 mtDNA 突变疾病的动物模型,Lee 等36设计了靶向小鼠线粒体基因Nd5的 DdCBEs,在体外将其转录成 mRNA 并显微注射进合子中,成功诱导出了 mtDNA 中 C12539T 和 G12542A 的突变,并在 F0 代成年小鼠的各种组织中检测到编辑,证实了受精卵注射 DdCBEs 诱导产生的线粒体编辑可在整个发育过程中得到维持。将雌性 F0 小鼠与野生型雄性小鼠杂交后,F1 小鼠中也可检测到靶位点的突变,表明了 DdCBE 诱导的突变可以通过母系遗传到下一代36。与此同时,Guo 等37在小鼠 N2A 细胞中筛选出靶向 G7763 和 G2820 位点的高效 DdCB
22、Es 组合,将转录产物注射到小鼠的受精卵中,成功模拟了人线粒体上的 G8363A 和 G3376A 突变。为进一步提高在小鼠中的编辑效率,Lee 等38将靶向 mtDNA 的 TALENs(mitoTALENs)与 DdCBEs 共注射到受精卵中以切割未编辑的 mtDNA,同时在 DdCBEs 中加上出核信号(NES)以提升其进入线粒体的能力,可以得到编辑效率达46.2%的 mtDNA 突变个体,表型分析显示小鼠的肾脏和棕色脂肪组织中的线粒体受损、海马萎缩,表现出与人类 G13513A 突变患者相似的驼背症状38。除了小鼠动物模型,Guo 等39将 DdCBE mRNAs 注射到斑马鱼一细胞期
23、受精卵中,在 F0 代的 G8892、G4247 和 G14076 位点处分别检测到高达 88.32%、23.48%和 67.9%的编辑效率,在 F1 代中,G8892A 和G4247A 的突变率最高分别为 84.33%和 40.42%。通过对 120 天龄的 F1 代 G4247A 个体和 45 天龄的 F0代 G14076A 个体进行游泳轨迹试验,发现其均表现出了明显的运动能力缺陷。使用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)对编辑后的斑马鱼骨骼肌进行分析,发现了线粒体基质中出现了明显的嵴退化和断裂。这些结果表明斑马鱼可通过精确的 DdCB
24、Es 编辑成为人 mtDNA 突变疾病的动物模型。Qi 等40在大鼠中找到与人类线粒体 G8363A 和 G14710A 突变对应的 G7755 和 G14098 位点,利用 DdCBEs 进行了高效的靶向编辑(编辑效率分别高达 36.33%和 46.73%)。与野生型大鼠相比,在突变个体的心脏和大脑中检测到 ATP 水平下降,同时,突变个体的运动协调和前肢握力受损,而学习能力和精神状态并没有受到影响。通过超声评估了 4 月龄 G14098A 的 F1 雄性大鼠心脏结构和功能,发4Hereditas(Beijing)2014第 36 卷现其表现出扩张型心肌病表型,心室扩大,室壁变薄,收缩功能下
25、降。这些工作为研究线粒体疾病的致病机制和临床基因治疗提供了重要的动物模型40。1 1.3.3 AAVAAV 包装包装 DdCBEDdCBE 介导线粒体介导线粒体碱基碱基编辑编辑DdCBE 介导的双链 mtDNA 脱氨产生的 dU 需要 DNA 的复制或修复机制来最终实现 CG 到 TA 的编辑,是否能在成体有丝分裂后的心肌细胞中进行 mtDNA 碱基编辑仍需探索。之前的研究表明,成年哺乳动物的细胞中不含心脏干细胞,心肌细胞不会分裂41,42。为此,Silva 等43通过用两个腺相关病毒载体(AAV)包装 DdCBEs 后,通过尾静脉注射递送至成年小鼠的心脏。注射后的第 3 和第 24 周,在小
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