湘派卤制品卤汁中黄曲霉毒素...的筛选鉴定及其产毒能力测定_林丽丹.pdf
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1、食品与发酵工业 ():引用格式:林丽丹,赵良忠,黄展锐,等 湘派卤制品卤汁中黄曲霉毒素产毒菌的筛选鉴定及其产毒能力测定 食品与发酵工业,():,():湘派卤制品卤汁中黄曲霉毒素产毒菌的筛选鉴定及其产毒能力测定林丽丹,赵良忠,黄展锐,周晓洁,艾道迎,周衡平,周劲松,郑奕柔,周凯(邵阳学院 食品与化学工程学院,豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室,湖南 邵阳,)(平江县劲仔食品有限公司,湖南 岳阳,)(深圳市通量检测科技有限公司,广东省高特异性生物快速检测工程技术研究中心,广东 深圳,)摘 要 以湘派卤制品卤汁为研究对象,对其贮存过程中产黄曲霉毒素的微生物(产毒菌)进行筛选鉴定并对产毒能力进行测定
2、。采用平板稀释涂布法和紫外荧光法对湘派卤汁进行产毒菌的初筛;对初筛菌株的 序列进行 扩增、测序,测序结果经 同源性对比、软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定;应用 检测各产毒菌培养液中黄曲霉毒素(,)含量,确定各产毒菌的产毒能力。经平板稀释涂布法、紫外荧光法和分子生物学共筛选鉴定出 株产毒菌株,其中有 株是黄曲霉(),株为寄生曲霉();经 法确定 株黄曲霉均不产生,寄生曲霉产生黄曲霉毒素()和黄曲霉毒素()。在第 天和第 天的含量分别为 、,在第 天和第 天的含量分别为 、;湘派卤汁由于贮存条件不当,易受霉变原辅料及环境的影响,存在产 的曲霉菌,警示湘派卤制品卤汁中存在 污染的安全风险问题。关
3、键词 卤汁;产毒菌;产毒能力;黄曲霉毒素;黄曲霉;寄生曲霉第一作者:硕士研究生(赵良忠教授和黄展锐讲师为共同通信作者,:;)基金项目:邵阳学院研究生科研创新项目();湖南省自然科学基金青年科学基金项目();湖南省教育厅科学研究优秀青年项目();湖南省科技创新计划资助目(;)收稿日期:,改回日期:湘派卤制品起源于卤菜之都 湖南邵阳,是我国的传统休闲美食。年,我国休闲卤制品市场规模已达 亿元,其中湘派卤制品因独特的风味和丰富的营养物质而颇受消费者喜爱。湘派卤制品是将原料放入事先熬制的卤汁(猪大骨、香辛料、菜籽油、调味料等)中多次卤制而成,所用卤汁的好坏直接决定卤制品的风味和品质。近年来,伴随着湘派
4、卤制品市场规模持续快速增长,缺乏安全管理的作坊式加工、采用廉价原材料、卤汁粗放保存及反复循环使用等现象已成为卤制品生产的趋势,而原材料不合格和加工工艺不规范易引起卤制品品质劣化,进而导致严重的经济损失。卤汁中潜在危害因子较多,一方面是原料带入的,另一方面是循环使用发生复杂化学反应产生的,主要分为化学性(美拉德反应产物、亚硝酸盐、重金属、过氧化值等)和生物性(微生物污染及其毒素残留)危害因子。近年来,卤汁微生物污染引起国内外学者的广泛关注。但关于卤汁中生物安全性危害因子的识别和监测,研究人员仅关注腐败菌和致病菌含量变化,或粗略地以样品中的菌落总数进行品质评价,忽略了真菌及其毒素污染的监控。此外,
5、由于湖南邵阳地域属亚热带季风性湿润气候,温暖潮湿的气候适宜真菌生长繁殖,因此极易引起卤汁霉变和真菌毒素污染,已成为制约休闲卤制品产业发展的瓶颈。黄曲霉毒素(,)是一类主要由曲霉属真菌产生的有毒次生代谢物,是已知毒性最大的霉菌毒素。包括、等多种亚型,其中 是迄今发现毒性最强的真菌毒素。性质十分稳定,在加工过程中难以破坏,暴露剂量为 时即可诱发强致病、致癌、致畸等毒性作用,已被国际癌症研究机构划定为类致癌物。因此,研究湘派卤制品卤汁中 产毒菌的筛选鉴定及其产毒能力测定对湘派卤制品质量安全控制具有重要意义。本研究对湘派卤制品卤汁在贮存过程中产 的微生物进行筛选鉴定及其产毒能力测定。采用平板稀释涂布法
6、和紫外荧光法对湘派卤汁进行产毒菌研究报告 年第 卷第 期(总第 期)的初筛,并应用 检测各产毒菌培养液中 含量,确定各产毒菌的产毒能力。该研究将为揭示湘派卤汁贮存过程中 消除机制奠定基础,并为卤制品加工产业的健康发展提供参考依据。材料与方法 实验材料 样品采集卤汁由豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室提供。仪器与设备高压蒸汽灭菌锅,宁波甬安医疗器械制造有限公司;恒温培养箱,上海三腾仪器有限公司;双人单面净化工作台,江苏通净净化设备有限公司;梯度 仪,杭州柏恒科技有限公司。试剂 培养基,上海博微生物科技有限公司;甲基化 环糊精,天津市大茂化学试剂厂;对照品(、),深圳市通量检测科技有限公司;甲醇
7、,盐城纳科医药有限公司。实验方法 产毒菌筛选在无菌室内将收集的样品吸取 于装有 无菌生理盐水的三角瓶内,用涡旋振荡器将样品混匀,得到 匀浆液,从 的匀浆液中吸取 加入到 支装有 无菌生理盐水的试管中,依次进行 倍稀释,得到 个梯度的稀释液,分别吸取 稀释液注入含有 的平皿中,用涂布棒涂布均匀,于 培养箱中倒置培养。每个稀释梯度设置 个平行。将疑似霉菌的菌落挑取出来在含有甲基化 环糊精的 培养基上进行纯化,采用点种法接种,继续培养 ,将长出菌落的平皿倒置于 的紫外灯下观察,若看到菌落周围有蓝紫色或黄绿色的荧光则初步判定为 产毒菌,将产生荧光的菌落再次划线分离、纯培养,最终得到的纯菌株采用甘油管藏
8、法保存并编号。菌株鉴定 形态学鉴定挑取产生荧光的单菌株于载玻片上,滴 滴乳酸石碳酸棉蓝染液,盖上盖玻片后静置,擦镜纸吸去盖玻片周围多余染色液,用光学显微镜先在低倍镜下观察菌株整体形态,后转高倍镜观察菌株的菌丝、孢子等形态。并结合真菌鉴定手册对初筛菌进行初步鉴定。分子生物学鉴定基因组 的提取按照提取试剂盒说明书提取各产毒菌株的,采用通用引物 扩增 序列。引物序列为:,:。反应体系为 ;引物各;基因组 ;聚合酶 ;。反应程序为预变性 ,;变性,;退火 ,;延伸 ,;终延伸,;扩增循环次数为 次。扩增产物用 琼脂糖凝胶电泳,将 产物送上海生工生物工程有限公司测序。得到的测序结果在 网站上进行比对后,
9、下载同源性高的序列用 软件中 法上构建系统发育树。法测定产毒菌的产 的能力 色谱条件色谱柱:(,);进样量;柱温;流动相:甲醇;一级水。采用梯度洗脱,条件见表。流速 。表 梯度洗脱条件 时间 质谱条件电喷雾离子源,正离子模式;离子源温度;离子喷射电压 ;加热气,雾化气,气帘气体。扫描方式为多重反应监测。标准溶液的制备准确称取、的标准品,用甲醇溶解、稀释制备成质量浓度分别为、共 个梯度的标准溶液。产毒培养液的制备霉菌产毒培养:将筛选得到的产毒菌株接种于 固体培养基上,培养 ,用已灭菌的(体积分数)吐温 洗取平板上菌落的分生孢子,得到 株菌的孢子悬浮液备用。将制备好的孢子食品与发酵工业 ()悬浮液
10、置于电子显微镜下用血球计数板计数,调整孢子浓度为 ,然后吸取 孢子悬浮液加入装有 沙氏液体培养基的锥形瓶中。在 、恒温摇床上分别培养 和 。的提取:用 层灭菌纱布过滤菌丝球培养液,收集产毒培养液于 离心管中备用。取 产毒培养液再加 纯水定量至 ,通过免疫亲和柱,控制流速为 ,用 水分 次洗脱,洗脱后将洗脱液弃去,用洗耳球将水吹尽,再加 纯甲醇洗脱,用注射器将管中上清液吸出,将注射器中的毒素提取液过 有机系滤膜,装入进样小瓶用 测定待测 含量。结果与分析 产毒菌的分离与形态学鉴定采用稀释涂布方法,对疑似霉变的湘派卤汁中的产毒菌进行分离、纯化,根据 在紫外作用下可发蓝紫光和黄绿色荧光这一特征,初步
11、筛选得到 株可产生黄绿色孢子的菌株,分别命名为、。菌落 在 培养基上生长较快,表面中间有些许的隆起并有类似褐色的桃胶物分泌,从中心呈圆环状向四周生长,质地呈致密丝绒状。菌落正面色泽随其生长由白色变为黄绿色,菌落背面呈褶皱状,颜色为浅褐色。分生孢子头呈疏松放射状或疏松柱状,分生孢子梗粗糙,顶囊呈近球形;分生孢子较为分散,呈球形或近球形(图)。菌落 生长较快,菌落表面中间隆起,质地为丝绒状且生长茂密。菌落正面初期为白色,直至第 天产生黄色孢子,菌落背面呈褶皱状,颜色为褐色。分生孢子梗的孢梗茎为浅绿色,壁较厚;顶囊呈椭圆形,光滑。该菌落的分生孢子较分散,呈浅绿色,形状为球形或近球形(图)。菌落 生长
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