铜绿假单胞菌中快速基因操作工具的开发和应用_李飞旋.pdf
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1、 李飞旋 等/铜绿假单胞菌中快速基因操作工具的开发和应用 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1789-1803 DOI:10.13345/j.cjb.220579 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资 助 项 目:国 家 重 点 研 发 计 划(2020YFA0906900,2018YFA0902700);中 国 科 学 院 科 研 仪 器 设 备 研 制 项 目(YJKYYQ20200033)This work was supported by the Nation
2、al Key Research and Development Program of China(2020YFA0906900,2018YFA0902700)and the Scientific Instrument Developing Project of the Chinese Academy of Sciences(YJKYYQ20200033).*Corresponding author.Tel:+86-755-26409621,E-mail: Received:2022-07-25;Accepted:2022-09-26;Published online:2022-09-30 17
3、89 生物工程学报 铜绿假单胞菌中快速基因操作工具的开发和应用 李飞旋1,倪磊2,金帆2*1 中国科学技术大学 合肥微尺度物质科学国家研究中心,安徽 合肥 230026 2 中国科学院深圳先进技术研究院 合成生物学研究所,广东 深圳 518055 李飞旋,倪磊,金帆.铜绿假单胞菌中快速基因操作工具的开发和应用J.生物工程学报,2023,39(4):1789-1803.LI Feixuan,NI Lei,JIN Fan.Development and application of a rapid gene manipulating toolbox for Pseudomonas aerugino
4、saJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1789-1803.摘 要:针对基因的操作,包括缺失和插入基因、替换基因元件(如启动子)、融合荧光蛋白基因、构建原位的基因报告系统,是大多数生物技术实验室的必备技术。目前广泛使用的基于 2 次同源重组的基因操作方法,在构建质粒、转化和筛选方面较为繁琐。另外使用该方法进行长片段敲除的效率较低。为了简化基因操作的流程,本研究构建了一个最小化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)整合型质粒 pln2,只需将目标基因内部一段序列克隆到 pln2 质粒并导入细菌,由于质粒不能在细菌内自
5、我复制而只能通过单次等位基因交换整合到基因组上,从而使目的基因断裂为两部分而失去活性。在 pln2的基础上开发了一整套工具质粒适用于基因组的不同操作,包括融合荧光蛋白基因、替换基因元件(如启动子)、构建原位的转录型荧光报告系统。此外,本研究借助该系统成功实现超长片段基因簇的敲除,单次可以敲除长达 270 kb 的片段。关键词:基因操作;单交换同源重组;铜绿假单胞菌;长片段敲除;新技术与新方法 生物技术与方法 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1790 Development and application of a
6、 rapid gene manipulating toolbox for Pseudomonas aeruginosa LI Feixuan1,NI Lei2,JIN Fan2*1 Hefei National Research Center for Physical Sciences at the Microscale,University of Science and Technology of China,Hefei 230026,Anhui,China 2 Institute of Synthetic Biology,Shenzhen Institutes of Advanced Te
7、chnology,Chinese Academy of Sciences,Shenzhen 518055,Guangdong,China Abstract:Manipulation of genes,including knock-out or knock-in,replacement of gene elements(such as promoters),fusion with a fluorescent protein gene,and construction of in situ gene reporter,is required in most of the biotechnolog
8、ical laboratories.The widely used gene manipulating methods based on two-step allelic exchange are cumbersome in terms of constructing plasmids,transforming and screening.In addition,the efficiency of using this method for long fragment knockout is low.To simplify the process of gene manipulation,we
9、 constructed a minimized integrative vector pln2.When a gene needs to be inactivated,an internal fragment of the target gene(non-frameshift)is cloned into the pln2 plasmid.Once the single-crossover recombination between genome and the constructed plasmid occurs,the endogenous gene is segmented by th
10、e plasmid backbone and thus inactivated.We developed a toolbox based on pln2 that can be used for different genomic operation mentioned above.With the help of this toolbox,we successfully knocked out large fragments of 20270 kb.Keywords:gene manipulation;single-crossover recombination;Pseudomonas ae
11、ruginosa;long fragments knockout;new technologies and methods 几乎每个生物技术实验室都需要进行基因相关的操作,例如基因的敲除、插入、融合等。其中最常用的是敲除,其他操作可以视为基因敲除的延伸。广义上的基因敲除是指使用一定的手段使基因组上特定的基因失活或缺失,从而丧失功能。而通常来说则是利用 DNA 同源重组的原理,从基因组上替换或删除目的基因。在研究基因功能和调控网络、构建生物模型或者底盘生物时,或为了在实验中避免某个基因对实验的干扰,都需要用到基因敲除。伴随着现代生物技术大规模、高通量的发展趋势,近些年快速涌现出一批基因操作(其中
12、包括敲除)的新方法,例如规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其衍生技术,并应用于高通量的功能调节与筛选1-3。这些工作同时也都需要文库构建和高通量测序手段。然而落实到具体验证阶段的很多工作中,仍然需要逐个构建不同基因的缺失突变株或进行基因插入、融合等操作。经典的基因敲除方法是利用 2 次同源重组双交换将靶标基因替换为两侧带有 FRT 位点的抗性基因,之后再利用FLP/FRT 系统将抗性基因从基因组删除。这一方法虽然经典但也较为繁琐。例如大肠杆菌中常用的 Red 系统敲除方案
13、4-5,通常包括如下步骤:(1)设计和构建敲除片段,该片段组成为上游同源臂+抗性基因+下游同源臂;(2)细菌导入 Red 系统并诱导表达;(3)细菌导入敲除 李飞旋 等/铜绿假单胞菌中快速基因操作工具的开发和应用 :010-64807509: 1791 片段;(4)使用含抗生素的培养基筛选敲除菌株;(5)验证菌株并消除 Red 系统。如果想要得到无抗性敲除株还需额外的操作。Baba 等利用这种方法构建了大肠杆菌 K-12 BW25113 菌株的单基因敲除文库,成功获得了 3 985 个单基因敲除菌株6-8。这些突变体文库不仅为系统分析未知基因功能和基因调控网络提供了基础资源,为在大肠杆菌 K-
14、12 BW25113 这一常见菌株背景下的全基因组突变效应测试提供了实验资源,也为系统生物学研究提供了实验数据来源8。另外一种模式微生物铜绿假单胞菌也是利用同源重组的原理来敲除基因。不同于敲除大肠杆菌基因时导入的同源片段为 PCR 扩增产物,铜绿假单胞菌基因敲除通常是将包含上下游同源序列和抗性基因的片段构建到包含 sacB基因的自杀质粒上9-10。之后的操作则和大肠杆菌基因敲除类似。Hmelo 等在上述方法的基础上进行改进,直接将靶标基因的上下游片段连接并克隆到敲除质粒,导入菌株后利用质粒本身携带的抗性基因和 sacB 基因进行 2 次筛选,进而可以得到纯净无痕的敲除结果11。这是一种力求精确
15、纯净的基因敲除技术。本研究则开发了一种“半精确”的基因敲除(还包括替换、插入等)方法,快速实现一系列基因操作但损失部分精确性,在操作简易性和敲除准确干净之间做个平衡。一般来说,在 生 物 体 内 单 交 换 同 源 重 组(homologous recombination)发生的概率要远高于双交换同源重组(double-crossover recombination)12-15,因此比较容易通过单交换同源重组将片段插入目标基因位置。其次,单交换同源重组对所用骨架质粒的要求也很简单,只需包含复制起始子(不能在敲除菌株中复制)和用以后续筛选的抗性基因即可,因此质粒很小,如本研究使用的质粒 pln2
16、 大小为 1 800 bp,是一般敲除所用质粒大小的 1/3。将目的基因内部部分片段(不移码)克隆到该质粒上,导入细菌后通过一次单交换同源重组,质粒被线性化整合到目的基因内部使其遭到破坏,这样就完成了目的基因的失活。在pln2 的基础上我们开发了一套质粒工具用于构建融合荧光蛋白、替换基因元件(如启动子)、构建原位的转录型荧光报告系统和大片段敲除(200 kb)等。1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌株 构建质粒所用感受态大肠杆菌为商业化Top10 菌株。基因操作实验中所用的菌种为铜绿假单胞菌 PAO1(ATCC 15692),来源于美国圣母大学 Joshua D.Shrout 实验
17、室。1.1.2 培养基 LB 液体培养基(g/L):胰蛋白胨 10,酵母提取物 5,氯化钠 10;固体培养基加琼脂粉 20。FAB 限制性培养基:硫酸铵 2 g/L,十二水合磷酸氢二钠 12 g/L,磷酸二氢钾 3 g/L,氯化钠3 g/L,氯化镁 93 mg/L,二水合氯化钙 14 mg/L,二水合硫酸钙200 g/L,七水合硫酸亚铁200 g/L,一水合硫酸锰 20 g/L,五水合硫酸铜 20 g/L,七水合硫酸锌 20 g/L,七水合硫酸钴 10 g/L,钼酸钠 10 g/L,硼酸 5 g/L。根据不同实验需要,碳源分别设置为醋酸钠 30 mmol/L 或谷氨酸钠 30 mmol/L。必
18、要时向培养基中加入抗生素,庆大霉素(gentamicin,Gen)终浓度分别为 30 mg/mL(铜绿假单胞菌)和 15 mg/mL(大肠杆菌),四环素(tetracycline,Tc)终浓度为 100 mg/mL(铜绿假单胞菌)和 10 mg/mL(大肠杆菌),羧苄青霉素(carbenicillin,Carb)终浓度为 300 mg/mL(铜绿假单胞菌)和 100 mg/mL(大肠杆菌)。ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1792 1.2 实验方法 1.2.1 质粒构建和提取 本文所有质粒均使用无缝克隆方法构建。
19、首先分别 PCR 扩增片段和载体,使两者具有 25 bp的互补同源末端序列,将两者按摩尔比 3:1 比例混合,加入等体积的 2Gibson Assembly Master Mix,50 反应 30 min。将反应液转化到 Top10 感受态细菌中,经抗生素琼脂板筛选后得到转化质粒,再经 PCR 鉴定和测序正确后保存使用。质粒提取使用商业试剂盒,按说明书操作。1.2.2 铜绿假单胞菌电转质粒和筛选 质粒使用电击转化法导入 PAO1 菌株。具体步骤:从新划线的 LB 平板上挑一个单菌落接种于 15 mL 新鲜 LB 液体培养基,37 过夜培养。第 2 天在室温下收集细菌,每支离心管收集 3 mL
20、菌液,离心后弃上清。用 10%蔗糖溶液重悬清洗 2 次并离心弃上清,加入 100 L 的10%蔗糖溶液重悬,得到电转感受态细菌。加入 5 L 质粒孵育 5 min 后,将感受态细菌转入2 mm 电转杯,使用 2.5 kV、5 ms 参数进行电击。电击程序结束后,迅速加入 0.5 mL 的 LB 培养基重悬细菌,并转移到离心管中,在 37 摇床复苏 2 h。取 100 L 菌液涂布到含相应抗生素的 LB 平板上,放置于 37 恒温培养箱培养过夜。抗性板上长出的单菌落,证明质粒已经插入细菌基因组中。挑取 4 个单菌落溶于 30 L ddH2O,95 裂解,离心后取上清液作模板进行 PCR 验证。长
21、度正确的 PCR 产物进行测序,进一步验证菌株正确性。将验证正确的菌株保存于甘油中,置于80 冰箱保存。1.2.3 抗性基因消除 大片段敲除实验的最后步骤,是消除插入基因组的抗性基因。在使用 pln2 和 pln2Tc 将 2 个同方向 FRT 位点和质粒插入目标片段两侧后,需要使用 FLP 位点重组酶删除 FRT 位点之间的片段和抗性基因。具体方案如下:(1)电转pFLP2 质粒,得到的双抗性细菌培养过夜,按照 1.2.2 所述方法,把 pFLP2 质粒电转到细菌中,培养 2 h 后取 100 L 菌液涂布到 Carb 抗性板上。pFLP2 质粒可持续表达 FLP2 位点重组酶,同时含有蔗糖
22、致死基因。(2)消除 pFLP2质粒,挑选上一步长出的单菌落划线到含 5%蔗糖的 LB 固体培养基上,培养过夜。(3)抗性验证,挑选上一步蔗糖板上长出的单菌落若干,溶于 30 L ddH2O,然后分别取 1 L 点到 LB 平板、LB+Tc 100 mg/mL 平板、LB+Gen 30 mg/mL平板和 LB+Carb 300 mg/mL 平板上,37 恒温箱培养过夜。只在 LB 平板上长出的菌落成功消除抗性基因和 pFLP2 质粒,也即成功删除了目标片段。抗性验证正确的菌株,通过测序进一步检验目标片段是否成功敲除。1.2.4 细菌培养 从80 冰箱取出实验所需的菌株,划线到新鲜的 LB 固体
23、培养基上,置于 37 恒温培养箱孵育 18 h。(1)细菌游动(swimming)观察实验,直接挑一个单菌落接种于 3 mL 新鲜 LB,37、220 r/min 摇床培养约 6 h,然后取菌液稀释观察。(2)吩嗪表达比较实验,挑一个单菌落接种于 1 mL 新鲜 LB,37、220 r/min 摇床培养约 10 h,测定菌液 OD600值。将不同启动子的菌液都统一稀释到 OD600=1.0,再分别取150 L 菌液转接到 3 mL 新鲜 LB 培养基中,放回摇床继续培养至 OD600值约为 0.8(后对数期)。(3)PilT 荧光标记,挑一个单菌落接种于 1 mL 新鲜 FAB+30 mmol
24、/L 谷氨酸钠培养基,37、220 r/min 摇床过夜培养。(4)aceA 启动子对不同碳源的响应实验,挑一个单菌落接种于 1 mL 新鲜 FAB+30 mmol/L 谷氨酸钠培养基,37、220 r/min 摇床培养过夜。测定菌液 OD600 李飞旋 等/铜绿假单胞菌中快速基因操作工具的开发和应用 :010-64807509: 1793 值,将菌液稀释到 OD600=1.0,然后分别取 50 L菌液添加到 1 mL 新鲜 FAB+30 mmol/L 谷氨酸钠培养基和 1 mL 新鲜 FAB+30 mmol/L 醋酸钠培养基中,放回摇床继续培养 6 h,之后用荧光显微镜观察并记录不同细菌的荧
25、光强度。1.2.5 细菌显微图像采集 细菌显微图像的采集使用本实验室的激光转盘共聚焦显微镜。采集荧光数据时,首先将菌液稀释到 OD600值约为 0.05,取 5 L 菌液滴到约 2 mm 厚的 1.5%琼脂糖片上,待菌液快干时将琼脂糖片倒扣于透明载玻片上。将载玻片放于倒置显微镜物镜载物台上然后使用商业化的 Andor 软件控制物镜寻找焦面,锁焦后使用集成的 Andor sCMOS 相机进行细菌的观察和拍摄。SfGFP 绿色荧光使用 488 nm 波段激光激发,荧光信号使用 520/20 nm 单通滤波片接收。拍摄细菌的明场图片时,则使用白光作为激发光源。1.2.6 细菌游动(swimming)
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