通络糖泰方治疗糖尿病周围神.的网络药理学和分子对接分析_李周泉.pdf
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1、目的:利用网络药理学筛选通络糖泰方(TLTT)治疗糖尿病周围神经病变(DPN)的活性成分,预测作用靶点及信号通路,探讨其作用机制。方法方法:采用中药系统药理学分析平台(TCMSP)收集 TLTT 的主要化学成分及作用靶点;利用基因卡片(Genecards)数据库检索与 DPN相关的蛋白;利用 STRING 数据库和网络可视化软件 Cytoscape3.9.1 构建蛋白-蛋白互作(PPI)网络;通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)和分子对接技术对靶点进行通路富集分析及成分-靶点对接。将 30 只 SD 大鼠随机分为对照组、弥可保组和 TLTT 组,每组 10 只,给予弥可保和 TLTT 灌胃
2、制备含药血清;复苏 1株 RSC96雪旺细胞,设置对照组、高糖模型组、弥可保组和 TLTT 组,采用细胞计数检测法观察各组细胞存活率,Western blotting 法检测各组细胞中丝氨酸/苏氨酸激酶 1(AKT1)和抑癌基因 TP53蛋白表达水平。结果结果:TLTT 治疗 DPN 的有效化合物成分 95个,463个靶点,DPN 相关蛋白 1 187 个,137 个药物-疾病共同靶点;基因本体论(GO)分析中生物过程、细胞组成和分子功能分别得到 5 505个、466个和 791个结果;KEGG 分析得到 253个结果,提示 TLTT 可能通过调节磷脂酰肌醇 3激酶/蛋白激酶 B(PI3K-A
3、kt)信号通路、液体剪切应力和动脉粥样硬化、晚期糖基化终末产物及其受体(AGE-RAGE)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路发挥治疗作用;分子对接分析,TLTT 通过槲皮素、豆甾醇、-谷甾醇、山柰酚和常春藤皂苷元等核心成分,作用于 AKT1、TP53、肿瘤坏死因子(TNF)和表皮生长因子受体(EGFR)等核心靶点。CCK-8法检测,与对照组比较,高糖模型组细胞存活率明显降低(P0.05);与高糖模型组比较,TLTT 组细胞存活率明显升高(P0.05)。Western blotting法,与对照组比较,高糖模型组细胞中 AKT1蛋白表达水平明显降低(P0.05),TP53 蛋白表达水平明
4、显升高(P0.05);与高糖模型组比较,TLTT 组细胞中 AKT1 蛋白表达水平明显升高(P0.05),TP53 蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论结论:TLTT 的主要活性成分槲皮素等可能通过靶向 PI3K-Akt等信号通路,促进雪旺细胞存活,升高 AKT1蛋白和降低 TP53蛋白表达水平,进而发挥治疗 DPN的作用。关键词 通络糖泰方;糖尿病周围神经病变;网络药理学;分子对接;雪旺细胞中图分类号 R285.5文献标志码 A文章编号 1671587X(2023)02034110收稿日期 20220522基金项目 四川省科技厅科研基金项目(2020YJ0440);成都中医药大学附属医院
5、科技发展基金资助项目(20YY14)作者简介 李周泉(1996),男,四川省成都市人,在读硕士研究生,主要从事中医药防治内分泌代谢疾病基础方面的研究。通信作者 殷丽平,副教授,副主任医师,硕士研究生导师(E-mail:)341第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报(医学版)Network pharmacology and molecular docking analysis on mechanism of Tongluo Tangtai Power in treatment of diabetic peripheral neuropathyLI Zhouquan1,LI H
6、ui1,TANG Ying1,YANG Lijun1,JIANG Yinghong1,YIN Lipin1,2(1.Department of Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine,School of Clinical Medical Sciences,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China;2.Department of Endocrinology,Affiliated Hospital,Chengdu University o
7、f Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China)ABSTRACT Objective:To screen the active components of Tongluo Tangtai Power(TLTT)in the treatment of diabetic peripheral neuropathy(DPN),predict the action targets and signaling pathways by network pharmacology,and to explore its mechanism.Methods:
8、The Traditional Chinese Medicine System Pharmacological Analysis Platform(TCMSP)was used to collect the main chemical components and action targets of TLTT;Genecard Database was used to retrieve the proteins associated with DPN;the protein-protein interaction(PPI)network was constructed by STRING Da
9、tabase and network visualization software Cytoscape3.9.1;pathway enrichment analysis and composition-target docking were analyzed by the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)and molecular docking technique.Thirty SD rats were divided into control group,mecobalamin group,and TLTT group,and th
10、ere were 10 rats in each group.The rats were given mecobalamin and TLTT by gavage to make the drug-containing serum;one stain of RSC96 Schwann cells was resuscitated;control group,high glucose model group,mecobalamin group,and TLTT group were set up;then cell counting method was used to detect the s
11、urvival rates of Schwann cells in various groups;Western blotting method was used to detect the expression levels of serine/threonine kinase 1(AKT1)and tumor suppressor gene TP53 proteins in the cells in various groups.Results:There were 95 active compound components and 463 targets in TLTT for the
12、treatment of DPN,1 187 DPN-related proteins,and 137 drug-disease common targets.The Geno Ontology(GO)analysis,including biological processes,cell composition,and molecular function)results obtained 5 505,466,and 791 results;the KEGG analysis obtained 253 results,suggesting that TLTT may played a the
13、rapeutic role by regulating the phosphatidyl inositol 3 kinase/protein kinase B(PI3K-Akt)signaling pathway,liquid shear stress and atherosclerosis,advanced glycosylation end products and their receptors(AGE-RAGE),mitosolysis-activated protein kinase(MAPK)singling pathways and so on;the molecular doc
14、king results showed that TLTT acted on AKT1,TP53,tumor necrosis factor(TNF),epidermal growth factor receptor(EGFR),and other core targets by some core components such as quercetin,sterol,beta-sitosterol,kaempferol,ivy saponin,and so on.The CCK-8 results showed that compared with control group,the su
15、rvival rate of the cells in high glucose model group was significantly decreased(P0.05);compared with high glucose model group,the viability of the cells in TLTT group was significantly increased(P0.05).The Western blotting results showed that compared with control group,the expression level of AKT1
16、 the cells in high glucose model group was significantly decreased(P0.05),and the expression level of TP53 protein was significantly increased(P0.05);compared with high glucose model group,the expression level of AKT1 protein in the cells in TLTT group was significantly increased(P0.05),and the expr
17、ession level of TP53 protein was significantly decreased(P0.05).Conclusion:The main active components of TLTT,such as quercetin,may promote the survival of the Schwann cells,increase the expression level of AKT1 protein and decrease the expression level of TP53 342李周泉,等.通络糖泰方治疗糖尿病周围神经病变作用机制的网络药理学和分子
18、对接分析protein by targeting PI3K-Akt and other signaling pathways,so as to play a role in the treatment of DPN.KEYWORDS Tongluo Tangtai Power;Diabetic peripheral neuropathy;Network pharmacology;Molecular docking;Schwann cell糖 尿 病 周 围 神 经 病 变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病常见的慢性并发症,60%90%的糖尿病患者会
19、在 10 年后出现不同程度的神经功能损害,其中半数为 DPN1,与创伤性 相 关 的 截 肢 患 者 比 较,其 5 年 生 存 率 低 于50%2,现已成为患者非创伤性截肢最主要的危险因 素,严 重 影 响 患 者 的 生 活 质 量3。目 前 关 于DPN 的发生机制尚未完全清楚,可采用控制血糖、饮食及生活方式干预、手术及对症治疗和病因治疗等方法治疗 DPN4-6。针对 DPN 中涉及的潜在分子和细胞机制的诸多治疗,包括醛糖还原酶抑制剂、苯酞胺和蛋白激酶 C抑制剂等,虽然已在临床应用40 余年,但因其皆为针对 DPN 单一发病机制的治疗,疗效有限7-9。中医药治疗 DPN 具有整体调节、毒
20、副作用小和临床效果好等特点。通络糖泰方(Tongluo Tangtai Power,TLTT)由黄芪、当归、地骨皮、水蛭、蚕沙、川牛膝、玄参、白芥子和赤芍等药物组成,是本院内分泌科谢春光教授的临床经验方,主要用于治疗 DPN。中药具有多成分、多靶点和多通路的特点,网络药理学10是探索药物成分与靶点相互作用的新兴研究方法。本研究通过探讨 TLTT 的主要活性化合物及其作用靶点,借助网络药理学的方法从系统生物整体的角度阐明TLTT 治疗 DPN 的作用机制,为 TLTT 的进一步应用提供科学依据。1 材料与方法 1.1TLTT有效成分筛选有效成分筛选在 中 药 系 统 药 理 学 数 据 库 与
21、分 析 平 台(https:/tcmsp- 以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)30%、类 药 性(drug-likeness,DL)0.18为筛选条件,筛选 TLTT 有效成分。1.2靶点预测靶点预测在 TCMSP 数据库中将成分 Mol ID 号输入相关靶点信息栏进行预测,再通过蛋白质序列数据库(https:/www.uniprot.org/)进行核对。1.3疾病靶点搜集疾病靶点搜集在基因卡片数据库(https:/www.genecards.org/)中以“diabetic peripheral neuropathies”为检索词,搜集疾病靶点。1.4核心靶点
22、筛选及构建蛋白核心靶点筛选及构建蛋白-蛋白互作蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络网络将成分靶点与疾病靶点交集得到的数据,输入 STRING 数据库(https:/string-db.org/),物种选择“人类”,置信度调整为“较高”,隐藏无联动靶点,在线导入 Cytoscape 3.9.1软件进行分析,在软件工具箱中选择“统计信息生成模式”,根据度值筛选出核心靶点。1.5TLTT-活性化合物活性化合物-核心靶点网络构建核心靶点网络构建将以上数据导入 Cytoscape 3.9.1 软件,构建中药-活性成分-核心靶点的网络。1.6基因本体分析及基因组通
23、路富集基因本体分析及基因组通路富集将交集靶点导入基因富集分析库(https:/metascape.org/)中,物种选择“人类”,选择基因本体论(Gene Ontology,GO)模式,完成生物过程(biological process,BP)、细 胞 组 分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3 个层面的富集分析,在京都基因与基因组百 科 全 书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)(https:/www.kegg.jp/)进行富集分析,将数据表格保存,结果以柱状图和气泡图
24、的形式输出。1.7分子对接分子对接从 蛋 白 质 结 构 数 据 库(http:/www.rcsb.org/)中获取靶点的蛋白结构,使用分子对接软件将核心靶点与活性成分进行对接验证。1.8核心靶点的验证核心靶点的验证1.8.1实验动物、细胞、试剂和主要仪器30 只SPF 级 SD 大鼠(成都森威实验动物有限公司,动物生产与使用许可证号:2021DL-020)。大鼠雪旺细胞(上海赛佰康生物技术股份有限公司,货号:RSC96)。TLTT 由黄芪、当归、地骨皮、水蛭、蚕沙、川牛膝、玄参、白芥子和赤芍等药物组成,由成都中医药大学附属医院制剂科制作,1 g 浸膏相当于生药 4.3 g,批号:202011
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