饲粮中益生菌的添加对绿壳蛋.睾丸发育及抗氧化功能的影响_李丹.pdf
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1、【目的】探究饲粮中添加益生菌(主要成分为芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌)对绿壳蛋鸡种公鸡睾丸发育、血液激素水平及睾丸抗氧化能力的影响。【方法】选取90只30日龄体重相近且健康的绿壳蛋鸡种公鸡为研究对象,将其随机分为2组,每组3个重复,每个重复15只鸡。对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中按照千分之一比例添加复合益生菌,饲养周期40周。待种公鸡达到性成熟高峰期时(240日龄),对2组种公鸡的精液品质、睾丸发育情况、血液激素含量及抗氧化酶活性进行测定。【结果】与对照组相比,试验组种公鸡的精子活力较对照组提高了5.6%,精子活率提高了9.5%,畸形率降低了21.4%,pH值也下降了1.5%,但两组间差异
2、不显著(P0.05);同时,睾丸中生精小管内精子量高于对照组;与对照组相比,试验组种公鸡血清中的睾酮(T)、雌二醇(E2)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(T-SOD)水平均极显著提高(P0.01),总抗氧化能力(T-AOC)水平显著提高(P0.05);与对照组相比,试验组种公鸡睾丸组织中Caspase-3和Caspase-9的表达量均有下降,但差异不显著(P0.05),而细胞增殖和周期相关基因PCNA、CDK2和CyclinD1的表达量均有增加。此外,试验组中抗氧化基因GPX2、GPX3、GPX4、GPX7、GST和GSR的表达量均显著或极显著高于对照组(P0.01,P0
3、.05),meanwhile,the amount of spermatogenic tubule in testis was higher than that in control group;compared with the control group,the serum levels of testosterone(T),estradiol(E2),glutathione peroxidase(GSH-Px)and superoxide dismutase(T-SOD)in experimental groups were very significantly increased(P0
4、.01),the total antioxidant capacity(T-AOC)level was significantly increased(P0.05).Compared with the control group,the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 in testes of experimental group were decreased,but the difference was not significant(P0.05),while the expression levels of proliferatio
5、n and CyclinD1 related genes PCNA,CDK2 and CyclinD1 were increased.In addition,the expression levels of antioxidant genes GPX2,GPX3,GPX4,GPX7,GST and GSR in experimental group were significantly higher than those in control group(P0.01,P0.05).【Conclusion】The supplementation of probiotics in the diet
6、 of green shell laying hens can improve the spermquality,enhance the antioxidant capacity of testis,and improve the reproductive capacity of breeding cocks to some extent.Keywords:probiotics;green shell laying hens;rooster;blood hormone levels;oxidation resistance抗生素被认为是医学上不可或缺的药物之一1,然而在现代畜牧生产中,抗生素的
7、使用甚至滥用使得耐药细菌的数量不断增加,其所带来的负面效益日益突出。为此,越来越多的国家和地区开始禁止将抗生素作为畜禽生长的促进剂2,这就使益生菌、微生物制剂等绿色健康的抗生素替代物成为了养殖业的研究热点。益生菌是一类有利于人、动物和植物生长的微生物的总称,包括细菌和真菌。当给予宿主足够数量的益生菌时,它能给宿主带来多种健康益处3-4。大量研究表明,益生菌作为饲料添加剂,对促进动物生长及改善养殖环境具有重要作用5-9。同时,它还可以改善动物肠道健康,增加肠道菌群的稳定性,抑制病原体的定植,从而降低发病率10-13。近年来,在家禽上,越来越多的研究也表明益生菌能提高家禽的生长性能,改善胃肠道的健
8、康,增强其对致病菌的免疫反应等14-15。如A.Rehman等16研究发现,在罗斯肉鸡中添加益生菌和益生元可以提高肉仔鸡的生长性能,同时还能提高传染性法氏囊病的抗体效应。Chen C.等17则发现饲粮中混合益生菌的添加能有效降低鸡白痢的死亡率,可调节肠道菌群平衡,防止鸡感染后发生白痢。此外,Yan F.等18报道称饲粮中益生菌的添加不仅改变了产蛋鸡盲肠微生物群组成,同时还降低了产蛋鸡无壳产蛋率,提高了骨矿化水平。综上可以看出,目前关于家禽生产中益生菌的研究主要集中在肠道菌群、生长性能和免疫性能等方面,鲜少有对公鸡繁殖性能的研究。随着现代蛋鸡养殖的发展,种公鸡高品质的精液品质是保证种蛋受精率的重
9、要前提基础,也是直接影响母鸡繁殖性能的关键因素。因此,种公鸡繁殖性能的优良就显得格外重要。基于此,本试验以绿壳蛋鸡种公鸡为研究对象,探究日粮中添加益生菌对绿壳蛋鸡种公鸡精液品质、血液指标和抗氧化性能的影响,以期客观评估其在绿壳蛋鸡种公鸡生产中的应用效果,从而为提高种公鸡的繁殖性能提供理论依据。1材料和方法1.1试验动物及分组处理本试验采用单因子试验设计,选取四川农业大学家禽育种场中体重相近且健康的绿壳蛋鸡种公鸡90只,随机分为2组,每组3个重复,每个重复15只鸡。对照组饲喂正常基础饲料和饮水;试验组除正常饮水外,则在基础饲粮中按1 g/kg直接添加复合益生菌复合益生菌购于山东苏柯汉生物工程股份
10、有限公司,以芽孢杆菌(1109 CFU/g)、乳酸菌(2107 CFU/g)和酵母菌(1107 CFU/g)为主。种公鸡30日龄时,试验组的日粮中就开始添加益生菌,直至34周龄。饲养期间的基础日粮主要为玉米-豆粕(营养水平详见表1)。所有种公鸡采用3层梯式笼养方式,每笼饲养1只鸡。在试验期间,种公鸡自由饮水,自由采食。舍内温度、湿度、光照以及免疫程序均依照四川农业大学家禽育种场 绿壳蛋鸡种公鸡的管理手册 进行。1.2睾丸样品采集与制备在饲养的第34周,随机从试验组和对照组中各353四川农业大学学报第 41 卷 选取3只种公鸡进行禁食、禁水处理,12 h后,称量试验组和对照组中种公鸡的体重,颈部
11、放血处死,随后采集公鸡两侧睾丸。将左侧睾丸用PBS清洗后,放入4%多聚甲醛中固定(每48 h换一次固定液),用于后续切片制作,而右侧睾丸则被放入液氮中冻存,用于后续RNA的提取和定量检测。1.3组织样品的制备与观察将前期固定好的睾丸组织用清水冲洗后,采用常规脱水、透明、石蜡包埋和苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色的方法,将切片制备成5 m厚度,放置于光学显微镜下观察。1.4精液品质测定在第34周时,采用背腹部按摩法采集精液(每个重复随机选取 8 只鸡),将采集好的精液置于37 水浴锅中保温,随后立刻按世界卫生组织(WHO)提供的精液质量测定方法19进
12、行精液品质的检测。1.5血液指标测定在240日龄时,分别对每组鸡用翅静脉采血法采集血液 2 mL,置于无抗凝剂的抗凝管中,随后2 000 r/min、4 离心20 min,离心后吸取500 L血清置于新的EP管中备用。参照ELISA试剂盒(江苏宝莱酶免生物科技有限公司)的使用说明,利用Varioskan LUX酶标仪测定种公鸡血清中的激素和抗氧化指标,包括睾酮(T)、雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)、促黄体激素(LH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(T-SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)。1.6睾丸组织中抗氧化和凋亡相关基因表达水平的测定1.6.1引物设计与合成根据G
13、enBank公布的鸡Caspase-3、Caspase-9、Bax、CyclinD1等基因序列信息,利用Primer 6.0软件设计特异引物(序列信息见表 2)。试验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因,所有引物均委托上海生物工程技术服务有限公司合成,为冻干品,使用时溶解于RNase Free ddH2O,稀释后引物浓度为50 pmol/L,分装保存于-20 冰箱备用。1.6.2荧光定量PCR将40 mg睾丸组织放于液氮中进行研磨,待其成为粉状后采用RNAiso plus试剂提取睾丸组织中的总 RNA。为除去 RNA 中的 DNA,采用 PrimeScriptTM RT reage
14、nt Kit 反转录试剂盒按其操作说明在含有 2 L 5 gDNA EraserBuffer,1 L gDNA Eraser,6 L RNase-Free ddH2O和1 L RNA的体系中 通 过 T100TMThermal Cycler PCR 仪,按 42 2 min、12 保存的程序进行。接着,在含有1 L PrimerScriptRT Enzyme Mix I,1 L RT Primer Mix,4 L 5 Primer Buffer 2(for Real time)和4 L RNase-Free ddH2O的反应体系中,通过37 15 min、85 5 s 的反应程序进行 RNA
15、反转录,反转录形成的cDNA置于-20 保存备用。在含有 1 L 引物(10 mol/L),1 L cDNA,5 L SYBR Green PCR Master Mix和3 L dd H2O的反应体系中检测睾丸组织中各基因的表达情况。反应在CFX96TMReal-time PCR仪(美国Bio-Rad公司)上进行,其反应条件为:98 2 min;98 2 s,X15 s(具体退火温度见表2),72 10 s,共39个循环。所有样品均进行3个技术重复。1.7数据分析实时荧光定量结果利用CFX Manager系统进行查看,并利用2-Ct的方法计算基因的相对表达情况;所有数据采用SPSS 19.0软
16、件进行单因素方差分表1基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)日粮组成Composition of diet玉米Corn豆粕Soybean meal麸皮Wheat bran玉米胚芽粕Corn germ meal猪油Lard oil石粉Limestone石粉(粗)Limestone碳酸氢钙CaHPO4氯化钠NaCl氯化胆碱Cloline chloride预混料Premix含量Content/%56.3026.202.403.500.802.306.001.340
17、.250.120.70营养水平Nutrient level代谢能ME/(MJ/kg)粗蛋白质CP/%粗脂肪EE/%粗纤维CF/%钙Ca/%总磷TP/%有效磷AP/%赖氨酸Lys/%蛋氨酸Met/%10.9817.043.472.683.400.630.370.860.39预混料为每千克饲料提供:维生素A 1 500 IU,维生素B1 1.8 mg,维生素B2 3.6 mg,维生素B6 2.8 mg,维生素B12 9 g,维生素D3 200 IU,维生素E 10 IU,泛酸10 mg,烟酸27 mg,氯化胆碱1 300 mg,生物素0.15 mg,叶酸0.65 mg,Fe2+80 mg,Zn2+
18、45 mg,Mn2+60 mg,I+0.35 mg,Cu2+8 mg,Se2+15 mg。营养水平为计算值。The premix provided in the following per kg of idets:VA 1 500 IU,VB1 1.8 mg,VB2 3.6 mg,VB6 2.8 mg,VB12 9 g,VD3 200 IU,VE 10 IU,pantothenic acid 10 mg,nicotinic acid 27 mg,choline chloride 1 300 mg,biotin 0.15 mg,folic acid 0.65 mg,Fe2+80 mg,Zn2+4
19、5 mg,Mn2+60 mg,I+0.35 mg,Cu2+8 mg,Se2+15 mg.Nutrient levels were all calculated values.354第 2 期李丹,等:饲粮中益生菌的添加对绿壳蛋鸡种公鸡睾丸发育及抗氧化功能的影响析,通过 Duncan 法进行多重比较;利用 Graphpad Prism 8 软件进行图表绘制。当 P0.05 或 P0.05)。同时,益生菌降低了种公鸡精子畸形率(21.4%)、精液量(8%)以及pH值(1.5%),但差异不显著(P0.05)(表3)。2.2种公鸡睾丸组织结构的变化为确定益生菌对种公鸡睾丸组织的影响,我们对其进行了HE
20、染色。HE结果表明益生菌添加前后种公鸡睾丸组织的被膜都是完整的,且实质内生精小管管腔大小不一,呈圆形或卵圆形,管壁由基膜和复层上皮组成;薄层基膜紧贴上皮,上皮较厚,可见精原细胞、精母细胞和精子细胞、精子和支持细胞等,各类细胞形态结构较为正常(图1A和图1C)。对比图1B和图1D发现,试验组中种公鸡生精小管内精子比对照组略多,且生精小管之间间质组织内可见血管;未见其他明显病理变化。2.3种公鸡血清生殖激素含量如表4所示,与对照组相比,饲料中添加益生菌表2RT-PCR引物序列Table 2Primer sequences for RT-PCR基因Gene甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)半胱氨酸
21、天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)细胞周期蛋白D1(CyclinD1)增殖细胞核抗原(PCNA)谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)谷胱甘肽过氧化物酶2(GPX2)谷胱甘肽过氧化物酶3(GPX3)谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)谷胱甘肽S-转移酶(GST)谷胱甘肽二硫还原酶(GSR)谷胱甘肽过氧化物酶7(GPX7)Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)序列号Sequence numberNC_052532.1NC_052535.1NC_000070.7NC_0525
22、65.1NC_052538.1NC_052536.1NC_052553.1NC_052543.1NC_052536.1NC_052544.1NC_052559.1NC_052534.1NC_052535.1NC_052539.1NC_052532.1引物序列(5-3)Primer sequenceF:GGTGGCCATCAATGATCCCTR:CCGTTCTCAGCCTTGACAGTF:TTCCACCGAGATACCGGACTR:AAACTGCTTCGCTTGCTGTGF:TCCCGGGCTGTTTCAACTTR:CCTCATCTTGCAGCTTGTGCF:TCTTCCGTATCTTCCGCA
23、CGR:ATGCGCTTGTTGGGATCGTAF:GTGATGGCATGGGACATAGCTCR:TGGCGTAGACCTTGCGGATAAF:TGTCGTTCGAACCCCTCAAGR:TTGCAGTAACTCGTCGGGTCF:AATGCGGATACGTTGGCTCTR:CACCAATGTGGCTGAGGTCTF:CAACGGCTTCAAACCCAACTTR:CCAGATGATGTACTGCGGGTTF:CGCCAAGTCCTTCTACGACCR:GGTGTAATCCCTCACCGTGGF:GGCCCTATGGACTTGTCGTCR:GAGGGCAGGAGTTCTTCAGGF:AGAAT
24、GGCGGACGAGTGGR:CAGCCCCTTCTCAGCGTATCF:CATCCGATGGCTGCTGTCTGCR:TCTGCACTGCACCAACTTCATCCF:GACTACAGCAACATCCCCACR:GTCCTTCCCATACACAGAGATGF:TTGTAAACATCAGGGGCAAAR:TGGGCCAAGATCTTTCTGTAAF:GGTGCTCACTTTAATCCTGR:CTACTTCTGCCACTCCTCC产物大小Product size/bp1051792071909015218415113320419815496140109退火温度Temperature/596060
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