生理性低氧及缺氧再复氧对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响.pdf
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1、北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023,Vol.31,No.282生理性低氧及缺氧再复氧对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响郭婷婷 刘怡 周建【摘要】目的 探索生理性低氧及缺氧再复氧对于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、成骨分化能力的影响。方法 体外分离培养 C57BL/6J 小鼠的 BMSCs,置于生理性低氧(3%O2)、常氧(21%O2)、缺氧再复氧环境,通过 CCK8 检测 BMSCs 增殖情况,同时成骨诱导,通过茜素红染色检测
2、体外矿化能力,RT-PCR 检测成骨向分化相关基因(Alp、Runx2、Opn)mRNA 水平;Western blot 检测 RUNX2、OPN、LC3-/LC3-I、P62、cleaved-caspase3 蛋白表达量。结果 生理性低氧较常氧 CCK8 表达显著升高,增加成骨相关基因(Runx2、Alp、Opn)mRNA 水平并促进 RUNX2、OPN 蛋白表达;缺氧复氧后,常氧组 LC3-/LC3-I 表达减弱,cleaved-caspase3 表达增强,Opn、OPN 较低氧组降低。结论 生理性低氧较常氧能促进BMSCs 的增殖、成骨分化能力。缺氧复氧过程中,生理性低氧较常氧可减缓无氧
3、干预对细胞增殖、成骨分化的抑制作用。【关键词】骨髓间充质干细胞;生理性低氧;缺氧复氧;细胞增殖;成骨分化【中图号】R681.1【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.02.002Effects of physiological hypoxia and anoxia-reoxygenation on proliferation and osteogenic differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells GUO Ting-ting,LIU Yi,ZHOU Jian.Depa
4、rtment of General Dentistry and Emergency Dental Care,Capital Medical University School of Stomatology,Beijing 100050,China【Abstract】Objective To investigate the effects of physiological hypoxia and anoxia-reoxygenation on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal s
5、tem cells(BMSCs)in vitro.Methods BMSCs of C57BL/6J mice were isolated and cultured in vitro and placed in physiological hypoxia(3%O2),normoxia(21%O2),and anoxia-reoxygenation environment.BMSCs proliferation was detected by CCK8,and osteogenic induction was conducted at the same time.In vitro mineral
6、ization ability was detected by alizarine red staining and calcium ion relative concentration.RT-PCR was used to detect mRNA levels of osteogenic differentiation-related genes(Alp,Runx2,Opn).Western blot was used to detect the protein expression levels of RUNX2,OPN,LC3-II/LC3-I,P62,and Cleaved-Caspa
7、se3.Results The expression of CCK8 was significantly increased in physiological hypoxia compared with normoxia,and the mRNA levels of osteogenic genes(Runx2,Alp,Opn)and the protein expressions of RUNX2 and OPN were increased.After anoxia-reoxygenation,proliferation and osteogenesis were inhibited in
8、 both the hypoxia and normoxia groups compared with the control group.Autophagy was inhibited in the normoxia group,the expression of Cleaved-Caspase3 protein was enhanced,and Opn and OPN were further decreased compared with the hypoxia group.Conclusions 3%O2 physiological hypoxia can promote the pr
9、oliferation and osteogenic differentiation of BMSCs compared with 21%O2 normoxia.In anoxia-reoxygenation,3%O2 hypoxia compared with 21%O2 normoxia could alleviate the inhibition of cell proliferation and osteogenic differentiation caused by the anaerobic intervention.【Key words】BMSCs;Physiological h
10、ypoxia;Anoxia-reoxygenation;Cell proliferation;Osteogenic differentiation骨骼在人体内具有支撑身体、保护内脏、完成运动和参与代谢等重要生理功能;因肿瘤、创伤、炎症及先天性疾病等造成的颌面部骨缺损严重影响患者的身心健康和生活质量。应用组织工程学技术联合间充质干细胞再生和修复骨组织,在基础探索方面取得了令人满意的临床效果,为治疗骨缺损增加了新的选择方案。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有干细胞多向分化潜能,还具有低免疫源性、易于获取等特点,它已成为骨缺损细胞治疗和骨组织工程领域中能有效发挥作用的理想工程细胞1,2。应用骨组织工
11、程修复骨缺损的治疗过程中需要慎重考虑 BMSCs 对目标组织微环境的耐受,而这也是其发挥生物学作用的关键。正常情况下,体外常规细胞培养中的氧含量为 21%,但组织内的平均氧含量约为 1%5%3,多种器官及组织内氧分基金项目:首都医科大学附属北京口腔医院学科建设基金(18-09-06)作者单位:100050 北京 首都医科大学口腔医学院急诊综合诊疗中心(郭婷婷),牙周科(刘怡),特诊特需科(周建)通信作者:周建,E-mail:,电话:010-57099518北京口腔医学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023,Vol.31,N
12、o.283压通常低于外界大气压,器官和组织内的适度低氧环境被称为“生理性低氧”4。骨折、局部骨坏死的情况下,其氧含量甚至可低于 1%以下5。目前低氧环境对 BMSCs 增殖、成骨分化的研究结果有一定偏差,缺乏一致性,但可以明确的是氧浓度对BMSCs 的生物学作用及其在再生医学中的作用是不可忽视的。对于损伤组织处于低氧环境的特性,明确 BMSCs 在低氧环境中的生物学特性以及对分化能力的影响是亟待解决的问题。本研究拟通过三气低氧培养箱,观察生理性低氧环境及缺氧再复氧过程中不同氧含量对于BMSCs 增殖能力和成骨分化能力的影响。旨在为BMSCs 在骨组织工程中获得理想的骨再生效果提供理论依据。材料
13、和方法1.实验动物实验动物为野生型 6 8 周 C57BL/6J 小鼠,由斯贝福(北京)生物科技有限公司提供,饲养于北京口腔医院动物实验室。小鼠购回后常规适应性饲养 1 周,实验前使其适应实验环境。2.实验主要试剂及仪器Trizol Reagent、RNA 逆转录试剂盒(Invitrogen公 司,美 国);茜 素 红(Sigma 公 司,美 国);QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒(Qiagen 公司,德国);osteopontin(OPN)及其内参引物、runt-related transcription factor 2(Runx2)及 其 内 参 引物、alka
14、line phosphatase(ALP)及其内参引物(上海生工生物工程有限公司,中国);-actin,Heat shock protein 90(Hsp 90)(Sigma-Aldrich 公司,美国);cleaved-caspase3(Cell-Signaling 公 司,美国)单克隆抗体 ALP(Biolegend 公司,美国);多克隆抗体 OPN、单克隆抗体 Runx2、多克隆抗体microtubule associated protein 1 light chain 3(LC3-II/LC3-I)、单克隆抗体 p62(Abcam 公司,美国);三气细胞培养箱(Thermo Scien
15、tific,美国);厌氧产气袋(型号:TX299-C-35,三菱公司,日本)。3.BMSCs 体外分离与培养6 周龄 C57BL/6J 小鼠脱颈处死,无菌条件下剪开小鼠后肢,剪开干骺端,1 ml 注射器吸取原代培养基反复冲洗骨髓腔,获得的细胞悬液转入离心管,1100 r/min 离心 6 min;弃上清,10 ml 含10%FBS 的-MEM 加入离心管底部的细胞团中,小心吹打制成细胞悬液,适度晃匀后置于 5%CO2、37 培养箱中培养。原代细胞培养至第 7 d 后第一次半换液,以后每 3 d 换液 1 次,多次换液传代使BMSCs 得以纯化,采用倒置相差显微镜观察细胞形态,P3 代用于实验。
16、4.BMSCs 的生理性低氧及缺氧再复氧的处理应用三气培养箱,通过控制 O2、N2和 CO2的输入量,用传感器来实现对氧含量的控制,使用3%O2+92%N2+5%CO2比例,达到生理性低氧的培养目的。将 BMSCs 随机分为 3 组,待细胞均匀贴壁后,实验组对细胞进行缺氧(0%O2)15 h 后再复氧的处理。复氧的环境为:常氧组(Normoxia,21%O2)、生理性低氧组(Hypoxia,3%O2)。不同孵育环境分组:生理性低氧组(Hypoxia):置于低氧环境(3%O2)中;常氧组(Normoxia):置于常氧环境(21%O2)中。缺氧再复氧实验分组:对照组(control):置于低氧环境
17、(3%O2)中;低氧组(hypoxia):置于无氧环境(0%O2)15 h 后放回低氧环境(3%O2);常氧组(normoxia):置于无氧环境(0%O2)15 h后放回常氧环境(21%O2)。5.CCK8 检测低氧环境对 BMSCs 细胞增殖的影响各组细胞制备成 3000 个/孔的细胞悬液 100 l,接种到 96 孔培养板,连续培养 7 天,每天每孔加入 10 l CCK8 溶液孵育 2 h。用酶联检测仪在 450 nm波长依序测量吸光度(optical density,OD)值。6.BMSCs 成骨诱导分化取第 3 代细胞以 2103/cm2 的浓度接种于 6 孔板中,待细胞生长至 80
18、%融合后,换为成骨诱导培养基(10 mmol/L-甘油磷酸钠,10 nmol/L 地塞米松,50 mg/L 维生素 C),将干细胞在体外向成骨方向分化诱导,每 3 d 换 1 次液,观察钙结节形成情况。诱导 7 d 后提取 RNA 和蛋白检测分析。2周后行茜素红染色及钙离子相对浓度测定来检测细胞体外矿化能力。7.RT-PCR 检测成骨相关基因表达 选取 BMSCs 成骨相关基因 Opn、Alp 及关键转录因子 Runx2 的表达以-actin 为内参进行 RT-PCR 检测。收集上述培养 7 d 的 6 孔板细胞,吸去培养基,加入 Trizol 500 l,5 min 后收集各样本于北京口腔医
19、学 2023年第31卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2023,Vol.31,No.284无酶 EP 管中,提取总 RNA。使用核酸蛋白分析仪检测 A260 nm/A280 nm 的比值及 RNA 含量确定其纯度。再按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 说明进行反转录,通过所得 cDNA 完成 PCR 反应。PCR 反应条件:95 10 min 预变性,进行40 个循环(95 变性 15 s,60 1 min,65 5 s,95 0.5 s),基因引物序列见表 1。8.Western b
20、lot 检测相关蛋白的表达选取 BMSCs 成骨相关蛋白(RUNX2、OPN),自噬相关蛋白(LC3-/LC3-I、p62),凋亡相关蛋白(cleaved-caspase 3)以 HSP90 为内参进行 WB。收集上述培养 7 d 的 6 孔板细胞,用冷 PBS 洗涤 2次,于冰上加入 RIPA 裂解液 100 l 并反复吹打细胞裂解,置于 4 冰盒上 30 min 后离心取上清液。测定蛋白浓度后,加热变性于-20 保存,每组根据蛋白浓度来计算上样体积,蛋白的总上样量为25 g 进行电泳、转膜、封闭,一抗 1:2000 孵育过夜,二抗 1:10000 孵育 2 h,利用化学发光试剂盒显影并采集
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