木犀草素调控内质网应激-线粒体凋亡通路在脂毒性心肌损伤中的作用.pdf
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1、木犀草素调控内质网应激线粒体凋亡通路在脂毒性心肌损伤中的作用项 云梁 潇鲍翠玉刘 涛(.湖北科技学院医学部药学院湖北 咸宁.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室.湖北科技学院附属第二医院)摘要:目的 探讨木犀草素()对 心肌细胞的保护作用及与内质网应激线粒体凋亡通路的关系方法 使用棕榈酸()建立 心肌细胞脂毒性损伤的模型将实验组分为正常组、模型组及木犀草素组(/)采用 法测定体外培养的细胞增殖水平利用试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶()、丙二醛()水平使用 检测细胞内活性氧()含量 荧光探针检测线粒体膜电位变化/测定细胞凋亡程度 法检测细胞在内质网应激线粒体凋亡通路中相关基因的表达 结
2、果 用(./)直接刺激 可明显降低 心肌细胞增殖率增加细胞氧化应激水平降低线粒体膜电位使、蛋白表达显著升高 蛋白表达降低但使用木犀草素处理后明显逆转了以上结果降低了 诱导的 心肌细胞氧化应激水平减轻细胞凋亡程度逆转了在 影响下细胞内内质网应激线粒体凋亡通路相关蛋白的表达 结论 木犀草素可减轻 诱导的脂毒性心肌损伤且这一过程可能与内质网应激线粒体凋亡通路有关关键词:心肌细胞高脂木犀草素内质网应激凋亡 中图分类号:文献标识码:文章编号:()开放科学(资源服务)标识码():./.():().().(/).()()()./.(./)湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()基金项目:国家自然科学基
3、金项目()湖北省自然科学基金项目()咸宁市科技计划项目()湖北科技学院校内培育科研项目()湖北科技学院五官医学院专项科研基金项()湖北科技学院校内科研发展项目附属第二医院专项()通讯作者:.:在健康个体中心脏脂肪组织调节心血管功能和能量分配然而心脏脂肪组织的异位沉积使它具有脂毒性加快心血管疾病的发展进程 内质网()是真核细胞中重要的细胞器负责脂类、蛋白质和碳水化合物的合成和修饰以及调节细胞内钙浓度 内质网应激被触发时产生大量未折叠或错误折叠的蛋白质导致钙离子浓度和脂质合成紊乱 细胞内甘油三酯()蓄积引起脂质损害时内质网应激对心肌细胞应激介导的脂质蓄积产生负面影响轻度的应激可以恢复 内稳态但强烈
4、且持续的应激则会引起心肌细胞凋亡产生或加重心血管疾病木犀草素()作为一种生物类黄酮具有抗炎抗肿瘤的作用且由于其抗氧化特性表现出了较好的糖尿病治疗作用 但目前木犀草素对脂毒性心肌损伤的保护作用及相关机制暂无报道因此本研究以内质网应激线粒体凋亡通路为切入点探讨木犀草素对 心肌细胞脂毒性损伤的保护作用及其与 线粒体凋亡通路的相关性 材料与方法.试剂 大鼠心肌细胞()、木犀草素(纯度 )()、高糖培养基()均购于大连美仑生物有限公司胎牛血清()购于浙江天杭生物科技股份有限公司棕榈酸()()购于美国 公司/双染细胞凋亡检测试剂盒()购于贝博生物丙二醛()()检测试剂盒、超氧化物歧化酶()()均购于南京建
5、成生物工程研究所活性氧()检测试剂盒()购于北京威格拉斯生物公司线粒体膜电位检测试剂盒()()购于碧云天生物科技有限公司()、()、()、()、()、()、()抗体均购于美国 公司.仪器细胞 培养箱(美国)多功能酶标仪(美国)多功能凝胶成像系统(美国)荧光定量 仪(美国)倒置荧光显微镜(日本)电泳槽、电转膜仪(美国)倒置相差显微镜(日本)恒温空气浴摇床(上海福玛实验设备).方法.与木犀草素的配制使用 无水乙醇溶解.棕榈酸()得到/的 母液 用无血清培养基配制得/的木犀草素储备液.实验分组观察 细胞生长形态待贴壁至 进行传代用含.胰酶消化细胞随后按合适比例接种至培养皿内根据本课题组的现有研究成果
6、将实验组分为正常组、模型组(/处理)、木犀草素组(木犀草素处理 ).()检测细胞增殖细胞传代后接种于 孔板待生长至 时给予 ./处理 木犀草素组使用木犀草素、/分别处理 每孔加入 溶液 孵育 测定 处的吸光度计算不同浓度木犀草素对 诱导心肌细胞增殖率的影响选取增殖率最高的木犀草素浓度进行后续实验.、生化指标测定将细胞分组给药孵育结束后冰上裂解细胞湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()离心取上清加入相应比例 溶液于水浴 下流水冷却离心 后收集上清加 上清液于 孔板中测定其在 波长处的 值 检测 时裂解离心后取 上清加于 孔板中随后按试剂盒要求加入相应 工作液测定 处 值计算 抑制率.水平
7、检测细胞分组给药孵育 弃去原培养基使用 洗一遍后再用无血清培养基洗两遍随后加入 工作液孵育 随后 洗两遍加入 再孵育 置于荧光显微镜下记录荧光强弱的变化.线粒体膜电位检测细胞接种于六孔板中分组给药孵育 取出后吸去孔内培养基用 洗 遍加入提前配制好的工作液放入培养箱内继续孵育 再置于冰上用 缓冲液清洗 次用荧光显微镜摄影记录.细胞凋亡检测将细胞分组给药接种于六孔板中 后去除孔内原有液体使用 清洗 次根据试剂盒使用说明向每孔加入 结合液随后再分别加入 和 溶液置于培养箱中避光孵育 洗涤孔内细胞 次立即置于荧光倒置显微镜下观察可见 发出红色荧光 发出绿色荧光.法检测蛋白表达观察细胞贴壁至 后分组给药
8、后取出用 洗 遍置于冰上裂解细胞于 低温离心下收集细胞吸上清液测定蛋白浓度配制合适比例的 胶进行凝胶电泳转膜后根据相应分子量切下条带使用脱脂奶粉封闭条带随后用 洗 遍一抗置于 冰箱内孵育过夜二抗放于室温下孵育 用现配制的 发光液显影用 分析条带灰度值.统计学方法使用软件 对收集的数据进行统计并分析采用单因素方差分析或 检验比较组间差异 .认为差异具有统计学意义 结 果.木犀草素对高脂诱导的 心肌细胞活性的影响 由图 可见与正常组相比模型组的细胞活性呈显著下降趋势与模型组相比木犀草素组细胞活性明显上升组间差异均具有统计学意义(.)结果显示木犀草素可逆转 造成的 心肌细胞损害与正常组相比.与模型组
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