去氢孕酮在水中的光化学转化过程及降解产物鉴定.pdf
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1、何智俐,高爽,李文彦,等.去氢孕酮在水中的光化学转化过程及降解产物鉴定 J.华南农业大学学报,2023,44(4):495-503.HEZhili,GAOShuang,LIWenyan,etal.PhototransformationandphotoproductidentificationofdydrogesteroneinwaterJ.JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity,2023,44(4):495-503.去氢孕酮在水中的光化学转化过程及降解产物鉴定何智俐1,高爽1,李文彦1,李永涛1,杨行健1,孙岩2(1华南农业大学资源环境学院,广东广州
2、510642;2广东省农业环境与耕地质量保护中心/广东省农业农村投资项目中心,广东广州510640)摘要:【目的】探究典型合成孕激素去氢孕酮(Dydrogesterone,DYD)在模拟太阳光下的光化学转化过程及转化路径。【方法】利用光化学反应器,测试模拟太阳光下 DYD 的光解动力学过程,探究不同 pH(5、7 和 9)、温度(15、25 和 35)和天然有机质(Naturalorganicmatter,NOM)质量浓度(0、5 和 20mgL1)对 DYD 光解速率的影响,利用超高效液相色谱飞行时间质谱(UHPLC-QTOF-MS)鉴定 DYD 光解后产生的潜在产物,并推测潜在的反应路径。
3、【结果】光照条件下 DYD 浓度逐渐降低,说明 DYD 发生了光降解过程。DYD 的光解速率受溶液初始 pH 影响不明显,一阶光解动力学速率常数(k)为 0.0150.019h1;DYD 的光解速率在高温和低浓度NOM 条件下有所提升(k 从 0.019h1分别升至 0.027 和 0.028h1),但在高浓度 NOM 条件下被抑制。UHPLC-QTOF-MS分析表明,DYD在光解过程中共生成19种产物,主要为羟基化、加氢、缩聚、光异构化以及开环后的反应产物。【结论】DYD 在地表水中会发生光降解作用,温度和 NOM 是影响其光解的重要因素;光解后形成的 19 种产物仍保留了 DYD 的分子骨
4、架,因此可能仍具有潜在的内分泌干扰效应。关键词:合成孕激素;去氢孕酮;光降解;光解产物;内分泌干扰中图分类号:S19;X592文献标志码:A文章编号:1001-411X(2023)04-0495-09Phototransformation and photoproduct identification ofdydrogesterone in waterHEZhili1,GAOShuang1,LIWenyan1,LIYongtao1,YANGXingjian1,SUNYan2(1CollegeofNaturalResourcesandEnvironment,SouthChinaAgricultu
5、ralUniversity,Guangzhou510642,China;2AgriculturalEnvironmentandCultivatedLandQualityProtectionCenterofGuangdongProvince/GuangdongAgriculturalandRuralInvestmentProjectCenter,Guangzhou510640,China)Abstract:【Objective】Toexplorethephototransformationofasyntheticprogestin,dydrogesterone(DYD),undersimulat
6、edsunlight,andidentifyitspotentialtransformationpathways.【Method】PhotoreactorwasusedtotestthephototransformationprocessofDYDundersimulatedsunlight.Experimentswerealsoconductedtoexploredifferent pH(5,7,and 9),temperature(15,25,and 35 ),and natural organic matter(NOM)concentration(0,5,and 20 mgL1)on D
7、YD phototransformation rate.Ultra-high performance liquidchromatography-time of flight mass spectrometer(UHPLC-QTOF-MS)was used to identify the potentialphotoproducts of DYD,and the potential transformation pathways were speculated.【Result】The收稿日期:20220402网络首发时间:2023042311:24:00首发网址:https:/ of DYD d
8、ecreased over time under simulated sunlight,indicating that phototransformationoccurredinthesystem.DYDtransformationratewasnotobviouslyaffectedbytheinitialsolutionpH,andthefirst-order phototransformation kinetic rate constant(k)was 0.0150.019 h1.DYD transformation rate wasfacilitatedbyhightemperatur
9、eandlowconcentrationofNOM(kincreasedfrom0.019h1to0.027and0.028h1,respectively),butwasinhibitedbyhighconcentrationofNOM.UHPLC-QTOF-MSanalysisshowedthat19photoproductsweregeneratedduringtransformation,viahydroxylation,hydrogenation,polycondensation,andphotoisomerizationwithsubsequentring-openingreacti
10、ons.【Conclusion】PhototransformationwilloccurforDYDinsurfacewater,andtemperatureandNOMplayimportantrolesinDYDphototransformation.Atotalof19photoproductsdetectedinthisstudyremainthebasicmolecularskeletonofDYD,indicatingthattheseproductswouldexhibitpotentialendocrinedisruptiontoaquaticsystems.Key words
11、:Syntheticprogestin;Dydrogesterone;Phototransformation;Phototransformationproduct;Endocrinedisruption合成孕激素是一类新兴环境内分泌干扰物,因其极强的生物活性引起了全世界的广泛关注1-3。合成孕激素通过模拟机体内源激素的生物学效应,干扰生物体内激素的合成、释放、转运、代谢等,从而影响生物体的繁殖能力、基因表达、生长发育和免疫功能4-6。例如,去氢孕酮(Dydrogesterone,DYD)在质量浓度 89ngL1水平下可导致斑马鱼Danio rerio 及其胚胎的基因转录发生明显变化6。黑头呆鱼
12、 Pimephalespromelas 持续暴露在2ngL1的炔诺酮溶液中 21d 后,其产卵量显著下降7。DYD 是众多合成孕激素的典型代表,广泛用于兽药和人类药物,包括人类避孕、促进动物生长和调节发情周期等2,5,8-9。目前,全球对 DYD 的使用量仍不清楚,但部分发达国家对其用量做了初步评估。例如,2004 年法国对 DYD 的消耗量达到744.70kg,在所有合成孕激素用量中排名第 28。当前暂无数据报道 DYD 在中国的消耗量,但博思数据研究中心行业报告中指出,中国自 2010 年起,口服避孕药的消费量逐年递增10。DYD 被人和动物摄入后无法完全代谢,因此通过尿液或粪便的方式直排
13、水体,或通过废水处理厂(Wastewatertreatmentplant,WWTP)不完全处理后进入水体11-12。例如在广州从化流溪河段检出 DYD,平均质量浓度为 9.6ngL113。DYD 进入地表水后,除了被悬浮颗粒和沉积物吸附,还会经历光化学转化、矿物催化转化以及生物转化等作用14-16。其中,光化学转化被认为是合成孕激素在地表水中的关键环境过程17-18。例如,在自然光照下,合成孕激素地诺孕素的直接光解半衰期为 110min14,而烯丙孕素的直接光解速率更快,半衰期仅 25s19。然而,目前鲜有 DYD在水中光降解方面的研究。另外,光降解速率还受到地表水的温度、pH、溶解性有机物等
14、多重因素的影响20-23。不同的环境条件通过影响合成孕激素的表面电荷和电离状态、反应底物分解、自由基生成等作用影响光反应过程23。另外,有研究报道显示,一些合成孕激素的光解产物的分子骨架较之于母物质未发生明显变化,因此产物仍具有相当的生物活性以及更高的环境持久性19,对水生生物可能造成不可预见的影响。因此,本文选取典型合成孕激素 DYD 作为研究对象,探究其在模拟太阳光下的直接光解动力学过程,并研究温度、pH 和天然有机质(Naturalorganicmatter,NOM)对直接光解的影响机制,最后通过超高效液相色谱飞行时间质谱(UHPLC-QTOF-MS)等手段鉴定 DYD 的主要光解产物和
15、反应路径,以期为厘清 DYD 在地表水中的环境过程及其环境风险提供依据。1 材料与方法 1.1 试验材料孕酮D9标准品(质量分数 98.3%)、水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯和异丙醇(色谱纯),购自上海安谱实验科技股份有限公司;DYD 标准品(质量分数98%),购自上海源叶科技有限公司;醋酸铵(质量分数99.0%)和醋酸(质量分数99.9%),购自上海麦克林生化科技有限公司;磷酸二氢钾和三水合磷酸氢二钾(质量分数99.5%),购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NOM 购自国际腐殖质协会(2R101N,IHSS 国际腐殖酸协会)。光降解试验用水(pH=7,溶解性有机碳质量浓度为 1.98mgL1)购
16、自新晖水处理设备有限公司。固相萃取小柱(SPE,Oasis,N-vinylpyrrolidone-m-divinylbenzenecopolymer,200mg,6mL)购置于 Waters 公司。496华南农业大学学报(https:/ 1.2 紫外吸收光谱测定配制 1mgL1的 DYD 水溶液,取 2mL 样品置于石英比色皿中进行紫外可见吸收光谱测定。紫外可见分光光度计(UV-2600,日本岛津有限公司)设置为全扫模式,检测波长范围 200800nm,狭缝宽1nm。1.3 光降解试验DYD 光降解试验于广州市(113.17E,23.8N)开展。该地区年平均温度 22.1,辐照度为 40060
17、0Wm2。光解试验在配置 1000W 氙灯和循环冷凝装置的光化学反应仪(购于上海科銮仪器有限公司)内进行。玻璃冷阱固定氙灯于光反应器中央,以保证四周光源的均匀性。向容积 600mL 玻璃光反应罐中加入 5mmolL1磷酸盐缓冲液 500mL,然后加入初始质量浓度为 100mgL1的目标孕激素母液 250L,最终形成 50gL1的反应液(甲醇体积分数91.2,定性离子为313.243.1,去簇电压为 107V,碰撞能为 77eV。光降解样品通过自动进样器进样,进样量 5L,通过液相色谱柱(2.1mm100mm 内径,3m 颗粒直径,购自天津博纳艾杰尔科技有限公司)分离,色谱柱前接保护柱(4.6m
18、m2.1mm,购自天津博纳艾杰尔科技有限公司),流动相为纯水(A)和乙腈(B),流速设置为 0.4mLmin1。梯度洗脱程序:乙腈初始体积比为 60%,保持 2.0min,在 3.0min 内升至 98%,并保持 1.8min,然后在 0.5min 内降至20%,保持 0.5min,在 0.5min 内升至 90%,然后在0.7min 内降至 20%,测定总时长为 9.0min。1.5 DYD 光降解产物的鉴定为了鉴别光降解产物,设置 4 个不同处理:T1 为甲醇,作溶剂空白;T2 为不添加 DYD 的体积分数为 0.05%的甲醇溶液,作基质空白;将 DYD 初始质量浓度升至 1mgL1,分别
19、开展避光处理(T3)和光照处理(T4)试验,试验步骤同“1.3”。采用SPE 小柱对试验样品进行浓缩净化。SPE 小柱先用 15mL 甲醇和 15mL 去离子水活化,然后放干。萃取前,向小柱中加入 3mL 去离子水,然后将光照样品通入小柱,同时调节真空度,让样品流速保持在 5mLmin1左右。萃取后,小柱用 4mL 乙酸乙酯淋洗 3 次,并收集萃取液。萃取液在高纯氮气下吹至近干,然后加入 2mL 甲醇,过 0.22m 滤膜后待测。4 种不同处理的样品分别用 UV-2600 和UHPLC-QTOF-MS(WatersAcquityIClassUPLC-XevoG2-XSQTofHRMS)分析,用
20、紫外吸收光谱鉴定目标合成孕激素的降解产物,步骤参见“1.2”。样品通过 UHPLC-QTOF-MS 自动进样器进样,进样量为 0.5L,然后用 C18 色谱柱(2.1mm100mm,颗粒直径 1.7m,WatersACQUITYUPLCCSHTM)进行分离,柱温为 40,流速设置为 0.35mLmin1。流动相 A 相为 5mmol/L 醋酸铵+0.1%()醋酸溶液,B 相为乙腈,洗脱梯度为:乙腈初始体积分数为2%,维持 0.5min,在 18min 内升至 98%,维持 6min,然后在 0.1min 内降至 2%,维持 2.9min,总检测时间为 27.5min。检测条件包括:ESI+模式
21、,碰撞气流速为 1.65Lmin1,离子喷雾电压为 1030V,离子源温度为 150。采集数据模式为 Sensitivity(质荷比 m/z:501000),毛细管电压为 1.75kV,脱溶剂气流量为 800Lh1,碰撞能为 6.0eV。产物鉴定过程中,先利用非靶向筛查数据处理软件包 pyHRMS 将UHPLC-QTOF-MS 采集的 Raw 数据文件格式转化为 mzML 格式再进行数据分析。T4 以 T1、T2 和T3 为对照,通过峰值拾取、峰值对齐、空白减法等过程,筛选出值得关注的特征峰,然后再做进一步处理。T4 所有的特征峰有特定的出峰时间和质荷比,根据筛选出来的特征峰对 4 种处理的峰
22、面积进行积分,使用 Python 中的 Seaborn 中的 Heatmap 功能进行绘图,根据颜色深浅体现峰面积的差异,即各特征峰对应的化合物在不同样品中含量的变化。第4期何智俐,等:去氢孕酮在水中的光化学转化过程及降解产物鉴定497 1.6 光降解动力学模型合成孕激素的光降解动力学数据可用一阶动力学模型拟合,公式如下:t=0ekt,(1)式中:t和 0分别为 t 和 0 时间点合成孕激素的液相质量浓度,gL1;k 为一阶光解动力学速率常数,h1。t1/2是降解半衰期,h,可用以下公式计算:t1/2=ln2/k。(2)为了测定温度对 DYD 的动力学,利用 Arrhenius方程计算活化能:
23、lnk=lnK0(Ea/RT),(3)式中:Ea为活化能,kJ/mol;R 为摩尔气体常数,8.314Jmol1K1;T 为光解反应的绝对温度,K;K0为频率因子,h1。1.7 数据处理与分析采用 UVProbe2.61 采集分析紫外吸收光谱数据,采用 ABSciexMultiQuantTM分析 AnalystSoftwareQuantitate 采集的 LC-MS/MS 数据,采用MassLynxV4.1 采集分析光解产物数据。所有数据采用 Excel2007、Origin2021b、Python2.7 和ChemDraw20.0 进行处理、拟合和绘图等工作。2 结果与分析 2.1 光解动力
24、学及其影响因素如图 1 所示,DYD 在避光条件下,其质量浓度()随时间基本保持稳定,说明 DYD 并未发生任何降解或吸附损失。光照条件下,DYD 的质量浓度随着时间逐渐下降,其浓度变化可用一阶动力学方程较好地拟合(R2=0.970.99,表 1)。结果表明,DYD 在水中的一阶降解动力学速率常数 k 在 0.0170.028h1范围内,降解半衰期 t1/2为 25.045.1h。由图 1 可知,pH 在 5、7 和 9 条件下的 k 和 t1/2均差异较小(P0.05),说明 pH 对 DYD 光降解的影响不大。随着温度升高,DYD 的降解速率有一定幅度提升,k 从 0.016h1增加至 0
25、.027h1。NOM 质量浓度为 5mgL1时的 DYD 光解的 k 是 0mgL1条件下的 1.43 倍,但 NOM 在 20mgL1条件下的 DYD光解的 k(0.0205h1)又下降至与 0mgL1条件下相近(k=0.019h1),说明 NOM 质量浓度升高,DYD 光解过程先促进后抑制。不同条件下反应前后溶液的 pH 动态稳定,说明 DYD 光降解对 pH 的影响不大。反应物从常态达到反应的过渡态所需要的能量为活化能 Ea,根据 Arrhenius 模型计算出DYD 光降解的 Ea为 19.21kJmol1,符合正温度效应,说明 DYD 发生光降解过程迅速24-25。(NOM)=0 m
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- 孕酮 水中 光化学 转化 过程 降解 产物 鉴定
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