红景天苷对心肌梗死小鼠心脏功能的保护作用.pdf
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1、229国际心血管病杂志 2023 年 7 月第 50 卷第 4 期 Int J Cardiovasc Dis,July 2023,Vol.50,No.4基础研究红景天苷对心肌梗死小鼠心脏功能的保护作用刘佳 武澎 陈彭生【摘要】目的:探讨红景天苷(SAL)对心肌梗死小鼠死亡率、心功能和心肌重构的影响。方法:小鼠随机分成假手术(Sham)组、心肌梗死未治疗(MI)组和 SAL 组,每组小鼠20只,通过结扎小鼠冠状动脉前降支建立小鼠心肌梗死模型,建模后SAL组给予SAL灌胃,MI 组和 Sham 组给予生理盐水灌胃,21 后检测各组小鼠的死亡率、心脏功能、心肌纤维化程度和梗死面积及炎症因子表达水平等
2、指标。结果:Sham 组、SAL 组和 MI 组的存活率分别为 100%、80%和 50%(P0.05)。与 MI 组相比,SAL 组的心脏质量与体质量比值、肺质量与体质量比值、左室舒张末期内径和左室收缩末期内径明显降低,左室射血分数和左室短轴收缩率明显升高,梗死面积和瘢痕厚度明显减小,肿瘤坏死因子(TNF)-、转化生长因子(TGF)-1、白细胞介素(IL)-1、凋亡信号调节激酶 1(ASK1)等表达水平显著降低,Bcl-2、血管内皮生长因子(VEGF)、磷酸化蛋白激酶 B(p-Akt)、磷酸化内皮一氧化氮合酶(p-eNOS)的表达水平显著升高(P 均0.05)。结论:SAL 能够减轻小鼠心肌
3、梗死后的死亡率,改善心功能,降低心肌纤维化,促进血管新生,减小梗死面积并改善心肌重构。【关键词】红景天苷;心肌梗死;心肌重构doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2023.04.010Protective effect of salidroside on cardiac function in mice with myocardial infarction LIU Jia1,WU Peng 2,CHEN Pengsheng 3.1 Department of Clinical Laboratory,Xuzhou Central Hospital,Xuzhou 221009;
4、2 Department of Cardiology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029;3 Department of Cardiology,Xuzhou Central Hospital,Xuzhou 221009,China【Abstract】Objective:To investigate whether salidroside(SAL)therapy could reduce mortality,improve cardiac function and alleviate
5、 myocardial remodeling in mice with myocardial infarction.Methods:The mice were divided into Sham group,SAL group and myocardial infarction(MI)group.The mouse model of MI was established by ligating anterior descending branch of the coronary artery.Then mice in SAL group were treated with SAL intrag
6、astric administration and mice in Sham and MI group were treated with saline.After 21 days,the mortality,heart function,degree of myocardialfibrosis,infarct size and expression of inflammatory factor in each group was determined.Results:The survival rate was 100%,80%and 50%in Sham,SAL and MI group,r
7、espectively(P0.05).Compared with MI group,mice in SAL group had impoved heart function,degree of fibrosis,infarct size,apoptosis index and angiogenesis.In addition,the expression levels of tumor necrosis factor-,transforming growth factor-1,interleukin-1 and apoptosis signal-regulated kinase 1 were
8、decreased(P0.05),whereas the expression levels of BCL-2,vascular endothelial growth factor,p-Akt and p-eNOS were increased in SAL group(P0.05).Conclusion:This study suggests that salidroside could reduce mortality,myocardialfibrosis,infarct size and improve myocardial function and remodeling after m
9、yocardial infarction in mice.【Key words】Salidroside;Myocardial infarction;Myocardial remodeling基金项目:国家自然科学基金(82000335);徐州市科技项目(KC17125)作者单位:221009 徐州市中心医院检验科(刘佳);210029 南京医科大学第一附属医院心内科(武澎);221009 徐州市中心医院心内科(陈彭生)通信作者:陈彭生,E-mail:230国际心血管病杂志 2023 年 7 月第 50 卷第 4 期 Int J Cardiovasc Dis,July 2023,Vol.50,N
10、o.4急性心肌梗死(AMI)死亡率高,心肌重构是AMI 后慢性心力衰竭(心衰)的重要原因,可导致心室壁变薄、左室舒张和收缩功能障碍1。血管紧张素转换酶抑制剂和 受体阻滞剂等常用药物仅部分减缓心衰进程2,仍需寻找和开发新的药物。研究表明,AMI 后心肌细胞凋亡坏死,炎症细胞浸润,炎症因子释放,在心肌重构中发挥重要作用3-4。激活磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信号通路和内皮一氧化氮合酶(eNOS),能够促进缺血损伤的修复,促进血管新生和侧支循环的形成,改善梗死后的心肌重构5-6。红景天是我国传统的中药药材,红景天苷(p-羟基苯乙酯-d-糖苷,SAL)是红景天的活性成分,具有
11、抗炎、抗疲劳、抗缺氧等作用7-8。研究显示,SAL 还能够减轻心肌缺血再灌注损伤,防止动脉粥样硬化斑块形成9-12。本研究通过建立小鼠心肌梗死模型,探讨 SAL 对心肌梗死后心肌重构的作用及潜在机制。1 材料与方法1.1 小鼠心肌梗死模型建立与实验分组60 只 C57BL/6J 雄性小鼠(2025 g)饲养于清洁级环境中。研究遵循实验动物护理和使用指南,并经徐州医科大学实验动物伦理委员会批准。戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,监测心电图、心率和呼吸频率。行气管插管及机械通气,通过左胸切开术暴露心脏。使用 8-0聚丙烯缝合线在小鼠左心耳下缘 23 mm 处结扎冠状动脉前降支,心电图
12、 ST 段抬高和局部心肌变为灰白色则提示造模成功。缝合胸腔,使用吗啡(2 mg/kg,皮下注射)缓解疼痛。将结扎前降支的小鼠随机分为 2 组:心肌梗死未治疗(MI)组和 SAL 组。假手术(Sham)组小鼠采用相同的手术进程,但不结扎前降支。建模后SAL 组使用 200 mg/(kg d)SAL 灌胃 21 d,Sham组和 MI 组小鼠使用生理盐水灌胃 21 d。每组小鼠20 只。SAL 购自南通飞宇生物科技有限公司。1.2 超声心动图检测小鼠用 1%2%异氟醚蒸汽麻醉,经胸超声心动图采用 Vevo2100 成像系统(VisualSonics 公司,加拿大)和 30 MHz 中央频率扫描头测
13、量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)和左室短缩率(LVFS)。1.3 心脏质量与体质量比值和肺质量与体质量比值的测定术后 21 d 对小鼠称重并记录。处死小鼠进行取材,先用生理盐水进行肺脏灌洗,再用生理盐水进行心脏灌洗,分别取下肺脏和心脏,吸干残留生理盐水,进行称重并记录,计算得到心脏质量与体质量比值(HW/BW)和肺质量与体质量比值(LW/BW)。1.4 心肌梗死面积检测术 后 21 d 将 1 mL Evans 蓝 染 液(0.1 g/mL,BioSharp 公司,中国)注射到小鼠腹主动脉,迅速取出心脏,20 放置 30 min,再将心
14、脏横切成 4 5 片。切片在柠檬酸缓冲液(PBS,pH7.4)中37 孵育 30 min,加入 1%三苯基四唑氯化铵(TTC),在 4%多聚甲醛中过夜。心肌梗死区呈淡白色,非梗死区呈红色。梗死面积百分比通过ImageJ 软件计算。1.5 组织病理学检测术后 21 d 处死小鼠,取出心脏,于 10%的甲醛中放置过夜后石蜡包埋。苏木精-伊红(HE)染色评估心肌组织形态学改变,Masson 染色法观察心肌瘢痕厚度及纤维化程度。1.6 免疫组织化学染色石蜡包埋的切片经二甲苯脱蜡和乙醇复水,0.3%甲醇/H2O2孵育,加-平滑肌肌动蛋白(-SMA)、CD31 一 抗(1 200,Cell Signali
15、ng Technology 公司,美国)4 孵育过夜,二抗室温孵育 2 h,DAB 显色后,显微镜下观察并拍照,通过Image-Pro 软件计算-SMA、CD31 的表达水平。1.7 免疫荧光染色使用原位末端转移酶标记(TUNEL)试剂盒(Biouniquer 公司,中国)测定凋亡细胞的数量。采用 DAPI(1 g/ml,Sigma 公司,美国)染核,异硫氰酸荧光素(FITC)标记 TUNEL 阳性细胞,荧光显微镜下成像,使用 Image-Pro 软件进行计数。凋亡指数凋亡细胞数/1 000 个细胞 100%。1.8 Western blot检测分离小鼠左心室,提取蛋白后使用 BCA 法测定蛋
16、白浓度。利用 6%12%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离 20 g 蛋白,转移到硝化纤维素膜上,5%脱脂乳 25 封闭1 h,加入抗 eNOS、Akt、p-Akt-thr308、p-Akt-ser473、凋亡信号调节激酶 1(ASK1)、GAPDH 抗体(1 1 000),抗 p-eNOS 抗体(1 200),抗 Bcl-2、Bax231国际心血管病杂志 2023 年 7 月第 50 卷第 4 期 Int J Cardiovasc Dis,July 2023,Vol.50,No.4抗体(1 800)4 孵育过夜,二抗(1 500)室温孵育 2 h,ECL 试剂盒显色
17、,Bio-Rad 曝光机曝光,ImageJ 软件计算条带灰度值。1.9 酶联免疫吸附试验将20 mg心肌组织进行2次冻融,离心取上清,采用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(Bio-Swamp公司,中国)检测转化生长因子-1(TGF-1)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-1(IL-1)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平。1.10 统计学分析采 用 SPSS 22.0 和 GraphPad Prism 5 软 件 进行统计学分析。计量资料以均数 标准差表示,2 组间比较采用 t 检验,多组间比较采用单因素方差分析,采用 Kaplan-Meier 曲线和 Log-rank 检验进行生存
18、分析。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 SAL降低心肌梗死后的死亡率并改善心功能3 组小鼠术后 3 周的生存情况分析显示,Sham 组无死亡,SAL 组小鼠生存率为 80%,MI组生存率为50%。Kaplan-Meier曲线生存分析显示,使用 SAL 治疗后,心肌梗死小鼠的死亡率明显降低(P0.05)。3 组小鼠术前超声心动图指标差异无统计学意义。术后 3 周时,与 Sham 组相比,MI 组出现明显的心室扩张及收缩功能障碍,表现为 LVEDD 和LVESD 升高,LVEF 和 LVFS 降低(P 均0.05)。与 MI 组相比,SAL 组左室功能各项指标明显改善(P 均0.05
19、)。同时,SAL 组 HW/BW 和 LW/BW明显低于 MI 组(P 均0.05),见表 1。表1 3组心脏结构和功能指标比较组别LVEDD/mmLVESD/mmLVEF/%LVFS/%HW/BW/mgg-1LW/BW/mgg-1Sham组3.580.092.310.1367.442.3937.121.945.150.236.070.24MI组4.370.17(1)3.560.54(1)38.192.20(1)18.43.73(1)7.010.39(1)7.940.44(1)SAL组3.930.11(2)2.860.11(2)49.524.03(2)23.731.63(2)5.910.33(
20、2)6.730.32(2)注:与Sham组比较,(1)P0.05;与MI组比较,(2)P0.05注:A示3组小鼠心脏横切面TTC和Evans蓝染色结果;B示3组小鼠心脏病理切片Masson染色结果图1 SAL对小鼠心肌梗死后梗死面积和纤维化的影响Sham组ABSAL组MI组2.2 SAL减少心肌梗死后面积,减轻纤维化与 MI 组相比,SAL 组小鼠的梗死面积显著减小(P0.05),SAL 组心肌纤维化程度和瘢痕厚度均显著降低(P0.05)。见图 1、表 2。232国际心血管病杂志 2023 年 7 月第 50 卷第 4 期 Int J Cardiovasc Dis,July 2023,Vol.
21、50,No.4A表3 3组小鼠心肌组织炎症因子表达水平比较/gL-1组别TGF-TNF-IL-1Sham组23.969.0317.333.772.260.65MI组104.513.01(1)59.467.69(1)8.791.28(1)SAL组57.1514.82(1)(2)35.616.58(1)(2)4.941.00(1)(2)注:与Sham组比较,(1)P0.05;与MI组比较,(2)P0.052.4 SAL改善心肌梗死后心肌细胞凋亡MI 组小鼠缺血心肌组织凋亡指数显著高于Sham 组;与 MI 组相比,SAL 组小鼠凋亡指数显著降低(P0.05)。对凋亡相关蛋白表达的检测示,注:A为3
22、组小鼠心肌梗死后21 d的免疫荧光染色结果,TUNEL阳性细胞为绿色,DAPI阳性细胞为蓝色,TUNEL和DAPI同时阳性的细胞为凋亡的心肌细胞;B为Western blot检测3组小鼠心脏组织Bcl-2、Bax、ASK1的蛋白表达情况图2 SAL对小鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡的影响表4 3组小鼠TUNEL阳性细胞比例及心肌凋亡相关蛋白的表达水平比较组别TUNEL阳性细胞/%Bcl-2BaxASK1Sham组 4.052.620.750.200.360.280.590.28MI组38.385.67(1)0.330.12(1)1.700.57(1)2.890.77(1)SAL组23.076.56(
23、1)(2)0.820.31(2)0.890.15(1)(2)1.420.47(2)注:与Sham组比较,(1)P0.05;与MI组比较,(2)P0.05与 MI 组相比,SAL 组 Bcl-2 的表达水平显著升高(P0.05),SAL 组 Bax 和 ASK1 的表达水平均显著降低(P 均0.05),见图 2、表 4。Sham组MI组SAL组DAPITUNELMergeBASK1Bcl-2BaxGAPDHSham组MI组SAL组表2 3组小鼠心脏梗死面积和瘢痕厚度比较组别梗死面积/%瘢痕厚度/mmSham组 4.231.760.130.06MI组41.406.13(1)1.020.32(1)S
24、AL组18.136.13(1)(2)0.420.24(1)(2)注:与Sham组比较,(1)P0.05;与MI组比较,(2)P0.052.3 SAL降低炎症因子的表达与 Sham 组 相 比,MI 组、SAL 组 炎 症 因 子TNF-、TGF-1 和 IL-1 的水平均明显升高。SAL治疗后,与 MI 组相比,SAL 组 TNF-,TGF-1 和IL-1 的表达水平显著降低(P 均0.05),见表 3。233国际心血管病杂志 2023 年 7 月第 50 卷第 4 期 Int J Cardiovasc Dis,July 2023,Vol.50,No.42.5 SAL促进心肌梗死后血管生成与
25、MI 组相比,SAL 组梗死边缘区-SMA 和CD31 的表达水平明显升高(P 均0.05)。Western blot 检测显示,3 组小鼠心肌组织总 Akt 和 eNOS的蛋白表达水平的差异无统计学意义。与 MI 组相比,SAL 组 p-Akt(thr308 和 ser473)和 p-eNOS的蛋白表达水平均显著升高(P 均0.05)。ELISA法检测示SAL组VEGF的表达水平明显高于MI组(P0.05),见图 3、表 5。表5 3组血管新生相关蛋白的表达水平比较组别p-eNOSp-Akt-thr308p-Akt-ser473-SMA/%CD31/%VEGF/ngL-1Sham组0.350
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