管碟法测定抗生素效价讲义.pdf
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1、管碟法测定抗 生素效价目录456基本操作及注意事项检定的影响原因1J概述抗生素微生物检定法是国际上通用时、经典的抗生 素效价测定措施。伴随HPLC等化学分析技术的发展,某些抗生素效价的测定已被化学措施所替代,但因 为下列原因,抗生素微生物检定法,目前在各国药 典中仍占有主要地位。1.微生物检定法可直观、特异的I反应出抗生素药物 的抗菌活性,显示临床的特点。2.多组分抗生素因为不同组分生物活性的差别,化 学测定成果难以精确表征组分、构成、含量和活性 的关系。3.许多抗生素品种因为多种原因目前没有合适的化 学分析措施表征其活性。4.同步微生物法所需的仪器设备简朴,成本低。在中国药典2023年版二部
2、附录XI抗生素微生物检定法及2015 版药典中,详细描述了管碟法和浊度法测定抗生素效价日勺措施,根据企业生产及检测情况,主要是硫酸庆大霉素和硫酸庆大 霉素颗粒,采用抗生素管碟法测效价来计算含量,所以,此章 主要简介管碟法。抗菌活性 抗菌活性是指抗菌药物克制或杀死病原微生物的能力。抗生素的抗菌活性一般用效价来表达。在临床应用中,抗生素的抗菌活性可精确地反应抗生素的医 疗价值。如:硫酸链霉素798单位/毫克青霉素G钠 1670单位/毫克Z基本原理2023版药典二部附录及2023版药典,在合适条件下,根据量 反应平行线原理,利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用,比较原则品与供试品两者对接种的试验菌产生
3、抑菌圈的大小,测定供试品时效价。抑菌圈的形成两种互动作用:一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩 散作用;另一种是试验菌的生长作用。当培养到一定时间,琼脂培养基的两种互动作用到达动态 平衡时,琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即:在抑菌 圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度,试验菌生长受到克制,此处琼脂培养基成透明状;在抑菌圈边沿抗生素浓度恰好 等于抗生素最低抑菌浓度。量反应平行线原理:当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线 关系,且供试品和原则品的作用性质相同步,供试品和原则 品的两条量-反应关系曲线相互平行。(中国药典二部附录XIV 生物检定统计法)褊用雷图盛023年版二部附录要求,硫酸庆大霉素和硫酸庆大
4、霉 素颗粒测效价,选用短小芽抱杆菌作为试验菌。取短小芽泡杆菌CMCC(B)63202用勺营养琼脂斜面培养物,接种于 盛有营养琼脂培养基日勺培养瓶中,在3537培养7日,用革兰氏染 色法涂片镜检,应有芽抱85%以上。用灭菌水将芽抱洗下,在65 加热30分钟,备用。流程图一半固体琼脂斜面 一 制菌悬液冻干菌粉营养肉汤(复活)u穿刺管(保藏及传代用)备注:每经过一次培养箱培养,菌时代数就增长一代。参照:药物微生物学检验技术主编:苏德模马绪荣2023年出版1.复活从菌种保藏机构购回的原 则菌株,是冷冻干燥粉,需 经过复活。(冻干菌种为第0 代)无菌操作,将冷冻干燥菌种安甑用75%乙醇消毒后,用砂轮 在
5、安甑颈部刻线,用无菌纱布掰开,或灼热安甑顶部,立即 作灭菌湿纱布盖住顶部,安甑顶部便骤然裂开,小心移去玻 璃碎片,用一无菌毛细管吸收0.5-1 ml合适的液体培养基,直 插安甑底部,挤出营养肉汤培养基,在底部振摇使菌粉溶解,再将安甑内菌液吸出,接种至营养肉汤培养基。35-37度 培养18-二十四小时。(此为第一代)制保藏用菌株 将营养肉汤培养物,用接种针沾取菌苔(菌液),沿半固体 培养基中心向管底作直线穿刺。穿刺到保藏管中,一样温度 35-37度,培养18-24 h,然后,放置2-8度冰箱保存,作为保 藏及传代用的菌株。制工作用菌悬液试验用菌种穿刺管1支,按无菌操作要求,接种于盛有30ml 一
6、般琼脂培养基的大三角瓶中,旋转三角瓶使全部琼脂培养 基表面被菌液浸润,多出的菌液用吸管吸出弃入消毒液中。将已接种的三角瓶置3537时培养箱中培养710天,用 革兰氏染色法涂片镜检,应有芽抱85%以上,用灭菌水20ml 洗下芽抱,制成悬液,在65水浴中加热30分钟,即得。置 5冰箱中保存。革兰染色法 详细操作环节:涂片 干燥(自然干燥、培养箱内)固定(火焰)染色(包括初染、媒染、脱色、复染四步)涂片无菌操作及做涂片的过程染色 初染:草酸核结晶紫染1分钟,自来水冲洗。媒染:加碘液覆盖涂面染1分钟,自来水冲洗。脱色:加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,30秒 后自来水冲洗。复染:加沙黄(复红)复染
7、液30秒后,自来水冲洗白然干燥或用吸水纸吸去水分,镜检。染色的成果:革兰阳性菌呈紫色,革兰阴性菌呈红 色。图片染色环节酸结紫 草镂晶染 初n1 1mQV*染in 媒1m5%醇9乙薇色OS 脱3M愣nV爨燥检 干镜革兰染色原理 因为细菌细胞壁的构造和构成不同,将细菌分为革兰阳性 菌和革兰阴性菌。G+菌:细胞壁厚,肽聚糖网状分子形成一种透性孔障,当乙醇脱色时,肽聚糖脱水而孔障缩小,透性降低,故保存 结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保存在细胞膜上,菌体呈紫 色为革兰阳性菌。G-菌:肽聚糖层薄,交联涣散,乙醇脱色不能使其构造 收缩,其脂含量高,乙醇将脂溶解,细胞壁透性加大,结晶 紫-碘复合物溶出细胞壁,沙
8、黄复染后菌体呈红色为革兰阴 彳生菌。革兰染色注意事项 1.革兰染色成败日勺关键是脱色时间,如脱色过分,革兰阳性菌也可 被脱色而被误以为革兰阴性菌;如脱色时间过短,革兰阴性菌也会 被误以为是革兰阳性菌。所以必须严格把握脱色时间。2.选用培养18二十四小时菌龄日勺细菌为宜,若细菌太老,因为菌 体死亡或自溶常使革兰阳性菌转呈阴性菌。革兰染色成果-革兰KP 口性菌革兰及俄性菌革兰染色成果公基本操作及注意事项 管碟法日勺操作环节预试验试验准缸 双碟日勺制备 供试品、原则品溶液日勺制粒V4 菌层日勺制匕放置小钢堂滴加抗生素溶液 双碟日勺培养 抑菌圈日勺测量成果日勺可靠性检验及效价测定预试验:拟定最佳的试验
9、条件:调整试验菌的浓度、使用量、抗 生素浓度、培养基等,使抑菌圈的大小符合要求,即二 剂量法高剂量浓度原则品溶液所致的抑菌圈直径在18 22mm,三剂量法中间剂量浓度原则品溶液所致的抑菌圈 直径在1518mm.高下剂量之比为2:1.试验成果中抑菌圈直径不应该过大或者过小,在试验之前,能 够先做一种有关用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验,选择抑菌圈直径在1822mm的菌液浓度为试验用浓度(菌液浓度约为106个/mL)。批量试验中后期,菌液保存的时间过久,菌株就会逐渐衰亡,生长不一致,影响其对抗生素B勺敏感度,造成抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯,也会造成这么B勺成果。所以,菌液在
10、使用一段时间后,能够 重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中B勺稀释倍数。试验准备:双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌;容量瓶、定量 吸管的清洗;培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等.抗生素试验中,玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。因为清 洗方面的原因,它们还是轻易残留上次试验中的抗生素(庆 大霉素、争光霉素、链霉素等)或者被清洗用的杀菌剂(如 新洁而灭、洗洁精、去污粉等)污染,以至于在下次试验中 造成抑菌圈不正常的现象。所以,在清洗时要尤为注意多用 流水冲洗。双碟的制备:每只双碟加底层培养基约 20mL待培养基凝固后,将双碟 放入3537培养箱中彳寺用.无菌室工作台面可能因为使用时间已
11、久,变得凹凸不平或者倾斜,会 影响培养基菌层日勺厚度均匀性。菌层越薄,形成日勺抑菌圈越大,会给 试验造成很大日勺误差。我们能够在桌面上放置一块足够大日勺玻璃平板,确保双碟放置区域日勺平整。在双碟底部预先标识样品日勺高下浓度区 域,在加注培养基底层日勺时候,有顺序地按照一致方向排列。接下来 加注培养基菌层日勺时候,依然按照原来日勺位置与方向排列。这么,虽 然桌面不够水平,还是能够确保培养基菌层是在水平日勺培养基底层上 铺开,到达消除误差日勺目日勺。试验中加注的培养基假如温度太低,就轻易在内部结块,或 者加注到双碟之后不能及时铺开,使得培养基表面为非水平 面,会给试验带来误差。加注6080的培养基
12、底层之后,不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的 水蒸气,在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层 上,会给培养基菌层的加注带来影响。供试品、原则品溶液日勺制备:估计供试品日勺效价,根据试验要求设计供试品、原则品溶液稀释环节,平行制备供试品、原则品有关剂量日勺溶液.依企业产品,硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉素颗粒,采用日勺是二剂量法,试验中,制成高、低浓度日勺溶液。依中国药典2023版及2023版二部附录要求,抗生与关 别试验菌培养基灭菌缓冲 液PH值抗生素浓度 泊围 单位/ml培养条件PHIS温度日:时间/小时庆大霉素短小芽泡杆菌CMCC(B)63 202I7.&-8.07.82
13、.0-12.0353714-16国层欧J制备:注意菌层培养基温度;根据预试验拟定加入菌 层培养基的菌液量,注意 制备菌层的速度和平整 度.制备琼脂培养基菌层时,培养基温度过高或者受热时间太长 都会造成试验菌死亡。当菌种为非芽抱杆菌的时候,现象尤 为明显,甚至会出现无菌生长。所以,培养基应放在50水 浴中保温。当加入试验菌种混匀后,应尽快加注究竟层培养 基上。在试验的时候,假如从大瓶内用刻度吸管吸收带菌培 养基吸管中培养基量少极易冷却,加在底层培养基上就不 易均匀铺开,造成菌层厚度不均,影响到抑菌圈的直径。所以能够事先把配制好的培养基分装在具塞试管内,每管 5mL,湿热灭菌后放在50水浴锅内保温
14、(水浴温度:细菌 为4850,芽抱可至60)。试验中,再分别加入菌液混 匀,配制成带菌琼脂。震荡混匀后继续保温5min使培养基 温度回升,然后直接倒在底层培养基上,转动双碟使培养 基均匀铺开。放置小钢管放置小钢管时,注意管与管之间不能太接近,不然会引起相 邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大,相互影 响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边沿一样也不能太 接近,因为液面浸润作用,边沿的琼脂培养基菌层为非平面,会影响抑菌圈的I形状。小钢管放置时,要小心地从 同一高度垂直放在菌层培养 基上,不得下陷,不得倾斜,不能用悬空往下掉的措施。放置之后,不能随意移动,要静置5min,使之在琼脂 内稍下
15、沉降稳定后,再开始 滴加抗生素溶液。滴加抗生素溶液:注意原则品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序,确保滴加速度和加量日勺 均匀一致.滴加抗生素要按照SH-TH-SL-TL(二剂量法)或者SH-TH-SM-TMSL-TL(三剂量法)日勺顺序滴加。滴加之前,滴管至少要用被滴液体冲洗3次。在滴加抗生素到小钢管日勺时候,因 为毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留,继续滴加轻易造成气泡膨胀破裂,使溶液溅落在琼脂培养基表面造 成破圈。所以一旦毛细管中出现 气泡或者残留,就重新吸收抗生 素溶液进行滴加,毛细管口应防 止太细,滴加日勺时候离开小钢管 口距离不要太高。SL标品的低浓度TH样品日勺
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