蓖麻根腐病抗性鉴定及其SSR标记的初步建立.pdf
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1、 .():/.:./.刘海燕 陆建农 殷学贵 等.蓖麻根腐病抗性鉴定及其 标记的初步建立.广西植物():.():.蓖麻根腐病抗性鉴定及其 标记的初步建立刘海燕 陆建农 殷学贵 顾帅磊 谢 钰 张柳琴黄冠荣 刘朝裕 张肖肖 左金鹰(广东海洋大学 滨海农业学院 广东 湛江 )摘 要:蓖麻根腐病是茄腐镰孢菌()引起的根部病害严重影响蓖麻产量 抗源缺乏制约了抗病品种的选育 为寻找抗病种质、建立抗性分子标记该研究对 份蓖麻材料的抗性进行了表型和分子标记鉴定 结果表明:()浓度为 个的孢子悬浮液灌根是一种有效的接种方法以接种后枯萎天数为基础的 级评价法可作为鉴定标准()鉴定出 份抗病材料其中高抗为 份()
2、野生材料中抗病材料比率()远高于栽培材料()建议将野生材料尤其是中国华南野生材料的研究利用作为今后抗病育种的重要方向()初步建立了 个与抗性关联的 标记 该研究结果提供了有效的根腐病抗性鉴定方法和评价标准筛选出了一批育种迫切需要的抗病基因资源初步建立了可用于辅助选择的 标记为蓖麻抗根腐病育种奠定了重要基础关键词:蓖麻 根腐病 抗病性鉴定 茄腐镰孢菌 孢子悬浮液 中图分类号:文献标识码:文章编号:()():.:().收稿日期:基金项目:广东省科技计划项目()第一作者:刘海燕()硕士研究生研究方向为作物遗传育种().通信作者:殷学贵博士教授硕士研究生导师研究方向为蓖麻种质资源与遗传育种().().
3、()()().().:蓖麻()属于大戟科蓖麻属植物一年生草本或多年生草质木本是重要的工业用油作物 蓖麻的主要经济价值在于蓖麻油 由于独特的理化性质蓖麻油广泛应用于航空航天、机械制造、医药化工、纺织印染等领域(.)随着经济的发展国内外对蓖麻油的需求持续增加市场供不应求 然而由于缺乏高产抗病品种近十几年来我国蓖麻种植面积持续减少蓖麻籽进口依赖率持续高达以上蓖麻病害种类繁多中国报道的有 多种(汤健蓉等)国外报道的有 多种(.)其中枯萎病是最主要的病害其病原菌为尖孢镰刀菌蓖麻专化型(.)目前枯萎病还没有统一的鉴定方法和评价标准 国外常用的接种方法有浸根法(.)、病盆法(.)、灌 根 法(.)和浸种法(
4、.)浸根法和病盆法工作量大且繁琐不适合大批量鉴定浸种法虽然操作简单但接种感染率低其可靠性还有待验证(.)灌根法操作简单只要选择适宜的菌液浓度即可模拟大田发病条件对材料作出客观评价 国内根据茎叶病斑大小及数量将枯萎病抗性划分为 共 个等级(沙洪林等刘伟等)国外主要根据发病率(.)、死亡天数(.)和枯萎天数(.)进行抗性评价随着蓖麻在华南地区种植面积的增加发病程度也日趋严重平均发病率为 严重的地块超过 甚至全田死亡 经采样分离和基因组测序鉴定证明最主要的病害是根腐病病原菌为茄腐镰孢菌()(.)除病原菌不同之外根腐病发病症状与枯萎病完全相同均表现为根部维管组织变黑、叶片萎蔫、最后整株枯萎、根系腐烂而
5、死亡 目前尚无根腐病抗性鉴定方法、评价标准和抗性种质资源筛选方面的研究报道蓖麻是一个遗传多样性很低的物种(.)近 年 来 等()将目光投向了野生材料证明野生材料的遗传多样性高于栽培材料而中国华南野生材料的遗传多样性又高于已报道的其他蓖麻群体(汪亚菲等 .杨婷等)其中中国广东的材料遗传多样性最高其次是中国广西中国海南的最低(汪亚菲等 .)这意味着野生蓖麻材料尤其是中国华南野生蓖麻材料中可能蕴藏着更多的抗性材料本研究以 份蓖麻材料为对象通过对其进行表型和分子标记鉴定拟探讨以下问题:()期刘海燕等:蓖麻根腐病抗性鉴定及其 标记的初步建立蓖麻根腐病抗性鉴定的有效方法和标准()对野生材料尤其是中国华南野
6、生材料的育种价值作出科学评价筛选出一批育种急需的抗病资源()建立可用于辅助选择的分子标记为蓖麻抗根腐病育种奠定重要基础材料与方法.试验材料.蓖麻材料供试材料由 部分组成:一是广东海洋大学蓖麻课题组提供的 份自交系和杂交种二是来自 个国家 个地区的 份自交系、杂交种和少量野生材料三是 份中国华南野生材料.供 试 菌 株 供 试 菌 株 为 茄 腐 镰 孢 菌()由广东海洋大学滨海农业学院植物病理研究室分离、保存和提供.材料的种植用.的次氯酸钠溶液浸泡种子 经自来水清洗后用 温水浸种 洗净后播种于盛有灭菌营养基质的育苗盘每穴播 粒种子 当幼苗四叶一心时进行人工接种 在接种后第 天选择规格一致的幼苗
7、移栽到花盆中每盆 棵每个材料 盆.孢子悬浮液的制备及接种方法将试管保存的茄腐镰孢菌转接到 培养基上培养 打取直径.的菌饼接种到 培养基中扩繁 后加入无菌水刮取表面菌丝 层纱布过滤后用血球计数板在光学显微镜下计算分生孢子的数量用无菌水将孢子浓度调至 个 四叶一心时采用灌根法接种即在每株幼苗根际周围的基质中注射 孢子悬浮液 接种后的材料置于温室内培养温度 、相对湿度 自然光照明.抗病性鉴定采用接种后的枯萎天数和发病率作为评价指标只要有枯萎就算发病 接种后每天调查不同材料的发病时间、发病株数并计算发病率和抗病材料比率直至无新的发病株出现(本试验为)才停止调查抗性评价标准:级(高抗)以上 级(中抗)级
8、 级 级 发病率()(发病株数/调查株数)抗病材料比率()(级材料数 级材料数)/材料总数 .抗病性分子标记的建立.基因组 的提取与检测采用改良的 法()提取基因组 用的琼脂糖凝胶电泳检测 的完整性用 仪器检测 的质量和浓度统一稀释至 后 保存备用.多态性引物的筛选先构建极端抗、感材料的 混池用于筛选多态性引物 再用小群体抗、感个体验证筛选出的多态性引物并对非多态性引物进行再次筛选以防多态性引物的遗漏.扩增及产物鉴定使用 的反应体系包括模板 ()、引物 ()、(、.、聚合酶.、.)、扩增程序:预变性 变性 复性 延伸 共 个循环 终延伸 保存 扩增在()型 仪进行 扩增产物用 非变性聚丙烯酰胺
9、凝胶分离 恒压电泳分离.银染、水洗、显影后读带.基因型数据的读取 采用、数据记录电泳分离结果在相同位置上有带记为 无带记为.相关回归分析 参照单标记定位原理(翟虎渠和王健康)对 份材料作抗性和分子标记间的回归分析若回归关系显著则为抗病分子标记 用 .统计分析软件处理相关数据结果与分析.菌株的培养和孢子悬浮液的制备培养基上菌株长势良好(图:)光学显微镜下分生孢子形态正常(图:)经镜检孢子浓度为 个.抗病性鉴定不同材料的发病率存在明显差异(表)最低的为 有 份材料均为高抗最高的为有 份材料发病最快均为高感表明发病条件充分、抗性鉴定结果可靠(图)广 西 植 物 卷.菌落正面.菌落背面.分生孢子 标尺
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