炎症微环境中ERN1调节软骨细胞炎症因子的实验研究_梁利.pdf
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1、中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023,39(2):314-324杂志网址:http:/炎症微环境中ERN1调节软骨细胞炎症因子的实验研究*梁利,邓琳,罗瑞,冯乃波,李小丽,范梦恬,郭风劲(重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室,重庆 400016)摘要 目的:探讨内质网到细胞核信号1(endoplasmic reticulum-to-nucleus signaling 1,ERN1)基因对炎症微环境中软骨细胞炎症因子和软骨分解代谢的影响。方法:通过CRISPR-Cas9系统构建人ERN1基因敲除的C28/I2软骨细胞株(ERN
2、1 KO);从C57BL/6J背景的ERN1软骨特异性敲除(ERN1 cKO)小鼠软骨组织分离原代软骨细胞,分别为对照组(ERN1flox/flox)、ERN1 cKO组(ERN1flox/flox-Col2Cre+);在C28/I2人正常软骨细胞中过表达ERN1腺病毒(AdERN1),以AdGFP为对照组;实验采用10 g/L白介素1(interleukin-1,IL-1)诱导过表达ERN1软骨细胞或ERN1缺陷软骨细胞,形成炎症微环境,用qPCR和Western blot检测IL-1处理ERN1缺失或过表达ERN1细胞后,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、
3、IL-4、IL-6、IL-10等炎症因子和软骨分解代谢标志物基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)、含血小板结合蛋白基序的解整联蛋白及金属蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS5)的表达。前交叉韧带切除(anterior cruciate ligament resection,ACLT)术制作ERN1 cKO小鼠骨关节炎(osteoarthriti,OA)模型,免疫组化法检测软骨组织TNF和IL-1的表达。结果:成功将ERN1单向导
4、RNA(sgRNA)构建至LentiCRISPRv2载体,并在C28/I2细胞中成功筛选出ERN1敲除稳定细胞株。qPCR 结果显示,在体外炎症微环境中,敲除 ERN1可上调软骨细胞促炎细胞因子 IL-6和 TNF mRNA水平(P0.05),下调抗炎细胞因子IL-4和IL-10 mRNA水平(P0.05)。Western blot结果显示,当软骨细胞处于炎症微环境中,敲除ERN1可显著上调TNF表达(P0.05),增强ADAMTS5和MMP13的表达(P0.05),而过表达ERN1则显著抑制TNF表达(P0.05)。免疫组化法结果显示,ACLT术后ERN1 cKO可促进TNF、IL-1表达。
5、结论:ERN1基因通过调节促炎及抗炎因子平衡参与炎症反应。关键词 ERN1基因;炎症因子;软骨细胞;软骨分解代谢中图分类号 R329.2;R363.2+1 文献标志码 A doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.014Regulatory effect of ERN1 on biological properties of chondrocytes in an inflammatory microenvironmentLIANG Li,DENG Lin,LUO Rui,FENG Naibo,LI Xiaoli,FAN Mengtian,GUO Fengjin(
6、Department of Cell Biology and Genetics,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China.E-mail:)ABSTRACT AIM:To explore the effect of endoplasmic reticulum-to-nucleus signaling 1(ERN1)gene on the biological properties of chondrocytes in an inflammatory microenvironment.METHODS:The ERN1 knockout
7、C28/I2 human normal chondrocyte cell line ERN1 KO was constructed by CRISPR-Cas9 system.Primary chondrocytes from ERN1 cartilage-specific knockout mice with C57BL/6J background were isolated,and the experiments were divided into control group(ERN1flox/flox),ERN1 cKO group(ERN1flox/flox-Col2Cre+).ERN
8、1 adenovirus(AdERN1)was over-expressed in C28/I2 human normal chondrocytes,with AdGFP as the control group.Interleukin-1(IL-1)at 10 g/L was used in chondrocytes to form an inflammatory microenvironment.The expression of inflammatory factors tumor necrosis factor (TNF),文章编号 1000-4718(2023)02-0314-11
9、收稿日期 2022-08-22 修回日期 2022-11-01*基金项目 国家自然科学基金资助项目(No.81871769);重庆市科委面上项目(No.cstc2020jcyj-msxmX0175);重庆市科委博士后科学基金项目(No.cstc2021jcyj-bshX0214);重庆医科大学研究生拔尖人才培育项目(No.BJRC202019)通讯作者 Tel:15310288670;E-mail:314IL-4,IL-6 and IL-10,and cartilage catabolism markers matrix metalloproteinase 13(MMP13)and a dis
10、integrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5(ADAMTS5)in chondrocytes after ERN1 deletion or overexpression in the inflammatory microenvironment induced by IL-1 was detected by qPCR and Western blot.RESULTS:The ERN1 sgRNA was successfully constructed into LentiCRISPRv2 vector,and ERN1
11、knockout stable cell line were successfully screened in C28/I2 cells.qPCR results showed that in the inflammatory microenvironment in vitro,ERN1 deficiency up-regulated the mRNA levels of pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNF in chondrocytes(P0.05),and down-regulated the mRNA levels of anti-inflam
12、matory cytokines IL-4 and IL-10(P0.05).Western blot results showed that when chondrocytes were in the inflammatory microenvironment,ERN1 deficiency significantly up-regulated the expression of pro-inflammatory cytokine TNF(P0.05),and enhanced the expression of cartilage catabolism markers ADAMTS5 an
13、d MMP13(P0.05).The expression of TNF was significantly inhibited after over-expression of ERN1(P0.05).CONCLUSION:ERN1 regulates the inflammatory sensitivity of chondrocytes by regulating the levels of pro-inflammatory and anti-inflammatory factors,and then participates in the inflammatory response.K
14、EY WORDS ERN1 gene;inflammatory factors;chondrocytes;cartilage catabolism软骨细胞作为软骨中存在的唯一细胞,是软骨基质分解代谢的主要来源,其维持基质成分的平衡1。在正常生理条件下,软骨成分的降解和合成保持动态平衡。同时,由年龄、肥胖、代谢紊乱、创伤、劳损、遗传等因素引起的炎症都是诱发骨关节炎的重要因素2。据报道,炎症细胞因子如 IL-1 和TNF等通过调控炎症介质的产生和一系列基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族成员的表达,在骨关节炎(osteoarthritis,OA)的发病
15、机制中发挥着重要作用3。IL-1启动炎症相关信号通路的激活并刺激 MMPs的表达,从而导致软骨基质的破坏4。因此,抑制IL-1和IL-1诱导的炎症介质表达会减缓OA的进展5-6。大量研究表明未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)参 与 机 体 的 免 疫 应 答 和 炎 症 反应7-8。人肌醇需求酶 1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)是位于内质网膜的跨膜蛋白,由内质网到细胞核信号1(endoplasmic reticulum-to-nucleus signaling 1,ERN1)基因编码,是UPR的重要分子传感器,参与
16、调节蛋白质折叠和维持肉质网(endoplasmic reticulum,ER)稳态9。IRE1与软骨或骨骼生长和发育密切相关10。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的定向诱导可导致软骨产生Schmid型干骺端软骨发育不全病理变化11。IRE1的缺乏会增加软骨细胞的凋亡,而IRE1的激活会增强软骨 细 胞 的 活 力 并 减 少 骨 关 节 炎 中 相 关 细 胞 的凋亡10。虽然一些文献报道了IRE1在骨骼发育及相关疾病中的作用,但是IRE1对OA软骨细胞炎症反应的影响仍不清楚。本研究通过构建ERN1缺陷软骨细胞、ERN1软骨特异性敲除小鼠原代软骨细
17、胞及过表达ERN1重组腺病毒,观察ERN1在炎症微环境中对软骨细胞炎症和分解代谢的影响,探讨 ERN1/IRE1对炎症微环境中软骨细胞炎症因子和软骨分解代谢的影响。材料和方法1实验小鼠C57BL/6J背景的ERN1flox/+小鼠购自上海南方模式生物科技发展有限公司,相同背景的 Col2-Cre工具鼠由中国人民解放军陆军军医大学陈林教授馈赠。通过Cre-LoxP繁殖获得ERN1flox/flox对照(control)小鼠和 ERN1flox/flox-Col2Cre 软骨特异性敲除(ERN1 cKO)小鼠。所有动物研究均按照机构指南进行,并得到重庆医科大学伦理委员会的批准。2细胞、质粒和病毒2
18、93T细胞株由本实验室保存。人正常软骨细胞C28/I2、CRISPR-Cas9 载体 LentiCRISPRv2 及慢病毒包装质粒psPAX2、VSVG由美国纽约大学刘传聚教授馈赠。慢病毒包装用阳性对照质粒Lenti-GFP由本实验室保存。过表达ERN1腺病毒(AdERN1)及对照(AdGFP)由本实验室保存。3主要试剂BsmBI 酶、CIP 酶、T4 连接酶(NEB);T4 PNK 酶(TaKaRa);-EcoT14 I/Bgl digest DNA Marker(TaKaRa);STBL3 感受态(擎科生物);Polybrene、PEI(Sigma);嘌呤霉素(Abcam);型胶原酶(Wo
19、rthington);血清(BIOAGRIO);DMEM、DMEM/F12 培养基(BI);RIPA强裂解液、青链霉素(碧云天);Trizol试剂(Invitrogen);逆转录试剂盒、2SYBR Green(Novoprotein);抗 GAPDH 和含血小板结合蛋白基序的解整联蛋白及金属蛋白酶 5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif 5,ADAMTS5)抗体(Affinity);抗 MMP13 抗体(Proteintech);抗 IRE1315(CST);抗TNF和IL-1抗体(Novus);小鼠基因组
20、提取试剂盒(Bimake)。本实验中所有引物由北京擎科生物科技有限公司重庆分公司合成,见表13。4主要方法4.1构建C28/I2细胞敲除ERN1稳定细胞株(1)LentiCRISPR-sgERN1质粒构建:将合成的oligo引物正反义链退火形成双链DNA,T4 PNK酶加磷;BsmBI内切酶酶切lentiCRISPRv2质粒,质粒长度为14 873 bp,酶切后CIP酶去磷酸化,凝胶电泳弃掉约2 kb的小片段,胶回收纯化大片段;T4 DNA连接酶连接4 过夜;STBL3感受态转化涂板;挑取单克隆菌摇菌,测序;(2)慢病毒包装:将测序正确的质粒进行293T细胞慢病毒包装,包装质粒比例为 Lent
21、iCRISPR-sgRNA psPAX2 VSVG=3 2 1,以 Lenti-GFP 为包装效率阳性对照,PEI辅助转染;收集 7296 h病毒上清;(3)筛选 ERN1 敲除稳定细胞株:感染 C28/I2 细胞,以 Lenti-GFP感染为阳性对照,polybrene辅助感染;0.5 mg/L puromycin 筛选,当 C28/I2 空细胞杀死完后,收取部分感染慢病毒的细胞进行Western blot鉴定,将有明显敲低效果的细胞进行单克隆细胞株筛选,Western blot鉴定敲除效果。4.2小鼠基因型鉴定剪取 23周待鉴定小鼠脚趾,提取基因组;以基因组为模板,分别用ERN1 flox
22、引物和Col2-Cre引物进行PCR扩增;2%琼脂糖凝胶电泳;基因型结果判读:ERN1野生型只有361 bp一条 带,ERN1flox/+杂 合 子 有 361、486 bp 两 条 带,ERN1flox/flox纯合子只有486 bp一条带;Col2-Cre阳性有300 bp条带,阴性则无条带。4.3分离小鼠原代软骨细胞收集新生 6 d 的ERN1flox/flox对照(control)小鼠和 ERN1flox/flox-Col2Cre 特异性敲除(ERN1 cKO)小鼠;取下膝关节软骨;PBS清洗;1 g/L 型胶原酶37 消化1216 h;加含10%血清、1%青链霉素的 DMEM/F12
23、培养基培养,48 h换液传代。4.4qPCR(1)过表达ERN1:接种C28/I2细胞,待细胞贴壁后,分别加入最适滴度的AdGFP(对照组)和 AdERN1(过表达 ERN1 组),polybrene 辅助感染,感染5 h后更换新鲜的完全培养基培养;此外,根据实验在细胞感染AdGFP和AdERN1腺病毒5 h换液时,分别加IL-1使终浓度为10 g/L模拟细胞炎症微环境;(2)敲除ERN1:接种敲除ERN1的C28/I2细胞(ERN1 KO1和ERN1 KO2)及对照(parental);接种ERN1小鼠原代软骨细胞(对照组)和ERN1 cKO小鼠原代软骨细胞(NER/cKO 组);待细胞贴壁
24、,分别加IL-1使终浓度为10 g/L模拟细胞炎症微环境。收集IL-1作用36 h后的细胞,Trizol法提取RNA,参照试剂盒说明书逆转录为cDNA,进行qPCR测定。4.5Western blot细胞处理方法同qPCR;收集IL-表1小鼠ERN1基因型鉴定引物Table 1.Mouse ERN1 genotyping primersNameERN1 FloxCol2-CrePrimer sequence(5-3)F:ACCCAAGAGAAGGAAGCCAGAGAR:CCAGGGTCGAGACAAACAACAAGF:GAGGGTCCAGCCCGAGCTACTTR:GCATCGACCGGTAA
25、TGCAGGCF:forward;R:reverse.表2CRISPR-Cas9 oligo引物Table 2.CRISPR-Cas9 oligo primersNamesgERN1-1sgERN1-2sgERN1-3Primer sequence(5-3)F:CACCGACATCCCGAGACACGGTGGTR:AAACACCACCGTGTCTCGGGATGTCF:CACCGCTTAAGCATGGAGTCCACGGR:AAACCCGTGGACTCCATGCTTAAGCF:CACCGGAGAACCCTACCTACACGGR:AAACCCGTGTAGGTAGGGTTCTCCF:forward;R
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