源于白鹤球虫新种分子鉴定_王艳.pdf
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1、今日畜牧兽医3源于白鹤球虫新种分子鉴定 王 艳1,张志忠2,徐前明2(1.合肥野生动物园 230031;2.安徽农业大学动物科技学院 230036 )摘要:合肥野生动物园救助一例野生白鹤,在对该白鹤进行粪便检查时发现球虫卵囊,初步判定为艾美尔球虫;使用分子生物学的方法,根据 GenBank 中已发表的不同物种球虫的 ITS-1 基因(间隔转录区-1)序列采取同源性比对,取其保守区域设计特异性引物,建立白鹤球虫种的 PCR 鉴定方法,结果表示该方法可以从白鹤球虫卵囊样本中扩增出 539bp大小片段,与预期结果相同,同源性分析显示:该球虫分离株ITS1 基因与其他球虫毒株的核苷酸同源性都在 77
2、96之间,遗传进化树分析显示:所分离的白鹤球虫(Grane eimeria)和 Eimeria gruis 最接近,但不在一个分支上。由此可见,白鹤球虫与其他物种球虫不是同一种类,是一个新种。感染白鹤球虫种类较多,种类的确定有助于该病的预防和控制。关键词:白鹤;球虫;分子鉴定白鹤是濒危灭绝的动物之一,因其对环境适应能力较差,不能适应于人类经济活动导致的生存条件剧烈变化。因此,野外白鹤数量正在急剧减少。根据国际鹤类研究中心发布的数据,60 年代初期有几千只白鹤,而到了 1978 年全世界只剩下两百多只。国际生物学界认为白鹤濒临灭绝,将白鹤收录在 红皮书中作为警示。球虫病、血液原虫病是导致白鹤大批
3、死亡的主要疾病。我国禽类感染球虫较为常见,野生禽类也较为普遍,但白鹤发生该病较为少,白鹤球虫在国内外报道资料不为常见,累积资料较少,尚无详尽统计资料给予描述 ITS 基因在球虫虫种鉴定上的应用。本次对所分离的白鹤球虫进行鉴定,以便为白鹤球虫分类奠定基础。1 材料与方法1.1 病例来源采集粪便样品来自合肥野生动物园救助野生白鹤。1.2 细胞与载体提供自安徽农业大学动物科技学院寄生虫实验室的大肠杆菌 DH5;从 TaKaRa 公司购买的 pMD-19T 载体。1.3 主要仪器PCR 仪(AppliedBiosystems 公司);DYY-6C 型电泳仪(北京市六一仪器厂);全自动凝胶成像分析仪(上
4、海培清科技公司,型号 JS680D);DHP 恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司,型号 XMT-A7000);冷冻高速离心机(赛默飞世尔科技)。1.4 主要试剂琼脂糖,SDS 和 Tris 碱(均购自北京鼎国生物技术有限公司);BloodDNAkit(上海索莱宝生物科技有限公司);胶回收试剂盒(QIAGEN 公司);营养琼脂培养基(购自上海瑞楚生物科技有限公司);普通肉汤(上海乔羽生物科技有限公司);实验室提供的鲜血营养琼脂平板。PCR 扩增所用试剂:TaqDNA聚 合 酶、PCR 缓 冲 液、MgCl2、dNTPs、DNAMakerDL2000、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。姬姆萨染料(
5、购自Sigma公司)。2 方法2.1 PCR 扩增目的基因2.1.1球虫卵囊分离与纯化从合肥市野生动物园收集白鹤粪便,按照张龙乐等【2】报道的方法,采用饱和食盐水漂浮法进行球虫卵囊分离与纯化。2.1.2DNA 提取第一,将上述收集的 1105个球虫卵囊用玻璃珠打碎,加入 300L 细胞裂解液和 20L 蛋白酶 K 作用 4h,再向每管再加入酚和氯仿各 200L,小心颠倒混匀几下。13000rpm离心 13min。转移上清至新管。第二,加入 600L 氯仿:异戊醇(24:1),震荡 10s,14000rpm离心 3min。第三,取上清液至新管,再向该 EP 管中加入 2 倍体积即200L 的无水
6、乙醇。第四,在-20的冰箱中冷冻保存 30min。13000rpm离心13min。丢弃上清。第五,加入 500 L 的 75%乙醇注入 EP 管中,轻轻地转上几下,清洗下 EP 管,然后去掉液体。第六,干燥箱内干燥 20min。第七,加入 30 L 的 TE 缓冲液,来回吹打几次即可,所提取的基因组用于 PCR 反应。2.1.3引物的设计根据 GenBank.U88565 用 Primer5.0 设计一对引物,预计扩增的片段为 539bp,引物由华大基因生物技术有限公司合成。2.1.4PCR 扩增目的基因取根据模板的编号进行相应编号的 EP 管按照下面的体系加样:mix(Taq 酶和 dNTP
7、)12.5l上下游引物 各 1lDNA 模板 1ldd 水 9.5lTotal 25lPCR 反应参数如下:预变性:945min;变性:9445s;退火:5630s;复性:7230s;进行 35 个循环,完成后在 72延长 10min,于 4下保存。2.1.5琼脂糖电泳检测 PCR 扩增产物将 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳(100V,40min)后,全自动凝胶成像仪分析并拍照。4xperimental study on onlineE实验研究2.2 PCR 产物的纯化按照回收试剂盒回收 PCR 产物。2.3 重组质粒 PMD19-T-ITS-1 的构建2.3.1 连接 PCR 产物与 T 载体
8、连接体系如下:PMD-19T1lSolution 5lDNA 回收片段 3lddH2O1l总体积10l短暂离心后于 4下保存过夜。2.3.2转化方法步骤如下:第一,10L 连接产物与 100L 感受态细胞混匀后,冰上作用 30min。第二,然后 42作用 90s。第三,加入 1LLB 培养基,180r/min 振荡培养 1h。第四,12000r/min 离心 20s,去掉800L,剩余的用涂棒均匀涂布在Amp平板上,放置10min后,倒置恒温培养 16h。2.3.3 阳性菌的克隆鉴定用灭菌的枪头从平板上挑取 4 个单菌落,置入灭菌的 LB培养基中培养(含 50g/mlAmp)至饱和。然后采用菌
9、落PCR 方法对其鉴定。2.3.4 基因的测序与比对将经 PCR 鉴定为阳性的克隆送至上海生物工程公司进行测序鉴定,测定的序列经 NCBI 中 Blast 工具进行序列比对,同时采用 DNAstar 软件对其抗原性进行分析。3 结果与分析3.1 卵囊分离结果图 1 白鹤球虫卵囊形态特征(400)将所得球虫进行孢子化试验(置入 2.5%重铬酸钾溶液,28),发现该球虫最早孢子化时间约为 23h。对其卵囊形态观察,其大小约为 16-18m8-12m,孢子化后 4 个孢子囊,每个孢子囊中含有 2 个子孢子。在外形上,一端窄,一端稍顿,无极孔和极冒等结构。初步判定属于艾美耳球虫属。3.2 PCR 扩增
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