羊肉中貉源成分Real-t...me_PCR检测方法的建立_张谊.pdf
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1、羊肉中貉源成分 ealtime PC 检测方法的建立张 谊1,汤思凝1,梅汝蕃2,郝立武1,张书宏1,王秋悦2,郑百芹1*(1唐山市食品药品综合检验检测中心,河北唐山 063000;2河北科技师范学院动物科技学院,河北秦皇岛 066000)摘要 目的 检测羊肉中是否含有貉肉成分。方法 通过实时荧光定量PC 方法,以cytB 为靶基因设计特异性检测引物,选取8 个不同物种的肌肉组织样本为研究对象,根据其 Ct 值函数关系进行线性拟合建立标准曲线。结果 该检测方法所用引物能将貉与其他物种区分,特异性较强,且最低检测限可达到 32 pg/L,回收率在 9771%10436%,组内变异系数028%,组
2、间变异系数108%。结论 该研究建立的羊肉中貉肉源成分实时荧光定量检测方法具有良好的特异性和敏感性,可用该方法检测实际羊肉样品中是否有貉肉源成分,为羊肉制品掺假的检测提供简单快捷准确的技术手段和执法依据。关键词羊肉;貉肉;ealtime PC;掺假肉中图分类号TS2517文献标识码A文章编号05176611(2023)01017904doi:103969/jissn05176611202301040开放科学(资源服务)标识码(OSID):Establishment of a eal-Time PC Method for Detecting accoon Dog in MuttonZHANG Y
3、i1,TANG Si-ning1,MEI u-fan2et al(1Tangshan Food and Drug Comprehensive Inspection and Testing Center,Tangshan,Hebei 063000;2 College of Animal Science and Technology,Hebei Normal University of Science and Technology,Qinhuangdao,Hebei066000)AbstractObjectiveTo detect whether raccoon dog meat componen
4、ts are contained in muttonMethodWe designed specific detectionprimers using cytB as a target gene by real-time PC,selected muscle tissue samples from eight different species as study subjects,and estab-lished a standard curve by linear fitting according to their Ct value function relationship esult
5、The primers used in this detection methodcould distinguish raccoon from other species,with specificity,the lowest detection limit could reach 32 pg/L,the recovery rate was 9771%10436%,the intraclass coefficient of variation was 028%,and the coefficient of variation was 108%Conclusion The real-time f
6、luo-rescence quantitative detection method system for raccoon dog meat components in mutton established in this study has good specificity andsensitivity,and this method can be used to detect whether there are raccoon dog meat components in actual mutton samples,providing a simple,rapid and accurate
7、 technical means and law enforcement basis for the detection of adulteration of mutton productsKey wordsMutton;accoon dog meat;eal-time PC;Adulterated meat基金项目河北省高端人才项目;唐山市科技创新领军人才项目(21130243A)。作者简介张谊(1981),男,河北唐山人,畜牧师,从事畜产品质量安全研究。*通信作者,教授,硕士生导师,从事农产品质量安全检验研究。收稿日期20220225我国是羊肉产量大国,羊肉消费呈逐年增长的趋势,但掺假问题
8、一直是影响羊肉消费的关键问题,尤其是动物源性食品掺假是最常见也是最难鉴别的严重问题12。我国毛皮经济动物貉子养殖量大,每年会产出大量的貉子废弃肉,貉子胴体有可能成为羊肉掺假中一类。截至目前,已经开发了许多肉类掺假检测的检测技术,包括 ealtime PC(qPC)检测技术、近红外特征光谱技术、高光谱法、分光光度法和酶联免疫分析法等312。这些检测方法中,ealtime PC 特异性更强、灵敏度更高、成本更低,该方法在肉类掺假方面的应用已日趋成熟1318。该研究利用 ealtime PC,建立一种对貉肉源成分的快速检测方法,以期对羊肉及其肉制品中貉肉源的掺假进行定性及定量的检测,为量化羊肉成分研
9、究提供参考。1材料与方法11试验材料猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉购自秦皇岛某大型超市;羊肉、貉肉、狐狸肉、貂肉由河北省预防兽医重点实验室提供;吸附柱法动物组织基因组 DNA 提取试剂盒、磁珠法动物组织基因组 DNA 提取试剂盒购自北京天根科技有限公司;琼脂糖、DL2000 DNA Marker、2ES Taq MasterMix(Dye)均购自北京索莱宝科技有限公司。12仪器与设备NanoDrop 2000 核酸蛋白定量仪(美国Thermo Scientific 公司);DYY6D 型电泳仪(北京市六一仪器厂);高速离心机 FC5515(上海京工实业有限公司);台式高速离心机 TGL16G(上海安亭
10、科学仪器厂);Mx3000PAgilent(美国安捷伦 Stratagene 公司)。13试验方法131样品的制备。分别取猪、牛、羊、鸡、鸭、狐狸、貉、貂 8种动物的鲜肉组织样本各 1 g,放在高压灭菌处理过的研钵中进行液氮研磨,研成肉末后转移至冻存管中,于80 保存备用。132基因组 DNA 的提取。分别称取 100 mg 8 种动物组织肉末,按组织基因组 DNA 提取试剂盒操作说明提取 DNA,20 保存备用。133DNA 浓度纯度检测。用 NanoDrop 2000 核酸蛋白定量仪测定核酸浓度与纯度,记录 A260/A280及 A260/A230值;并将DNA 进行 2%琼脂糖凝胶电泳,
11、以检测其完整性。134PC 引物设计。参考相关文献1923,根据貉子线粒体 cytB 基因序列,并使用 NCBI Blast、MEGA 7 等软件将貉源cytB 基因与猪、牛、羊、鸡、鸭、狐狸、貂物种序列进行比对,筛选不同种物种间差异序列,设计特异性引物。选择较为保守的基因 16S rDNA 为内参基因,设计通用引物。引物序列如表 1 所示。135实时荧光 PC 反应条件的建立与优化。实时荧光安徽农业科学,JAnhui AgricSci 2023,51(1):179182,187PC 反应体系(20 L):上游引物(10 mol/L)04 L,下游引物(10 mol/L)04 L,2Perfe
12、ct StartTMGreen qPC Super-Mix 100 L,Nucleasefree Water 82 L,模板 DNA 10 L。预试验中在 4654 设置了梯度 PC,最后确定了 50 为退火温度,其扩增效果最佳。PC 反应条件:94 预变性 30s,94 变性 5 s,50 退火 15 s,72 延伸 10 s,共 40 个循环。表 1特异性引物和通用引物序列Table 1Specific primer and universal primer引物名称Primer name引物序列Primer sequence引物大小Primer sizebpcytBF:5TCTGTTCCT
13、CCACGAAACCG3126:5GAGGTGTAGTTGTCTGGGTC316SF:ACCGTGCAAAGGTAGCATAATCA82:GCTCCATAGGGTCTTCTCGTCTT136特异性引物和通用性引物检测。将提取 8 个物种基因组 DNA 进行稀释,浓度均为 50 ng/L,分别使用特异性引物 cytB 及通用引物 16S rDNA 进行 qPC 扩增,ddH2O 为阴性对照。根据所得曲线图及 Ct 值分析 cytB 引物的特异性和16S 引物通用性。137引物灵敏度检测。将初始浓度为 50 ng/L 的貉 DNA样本进行 5 倍梯度稀释,使其终浓度分别为500 ng/L、100
14、ng/L、20 ng/L、4000 pg/L、800 pg/L、160 pg/L、32 pg/L,分别以其为模板进行 qPC 扩增,ddH2O 为阴性对照。根据曲线图及 Ct 值分析特异性 cytB 引物所能扩增的最低检测浓度。138定量标准曲线建立。按照总质量为 100 mg,貉肉含量分别为0、10%、30%、50%、70%、90%和100%的比例与羊肉混合,混合肉样提取 DNA 后,统一稀释初始浓度为500 ng/L,进行 qPC 扩增。每个样品做3 个重复,结果以?xS 表示,采用相对定量法建立标准曲线。139标准曲线准确性验证。以总质量为 100 mg,貉肉含量分别为 5%、15%、4
15、5%、65%和 95%的貉羊混合肉进行 DNA提取后,统一稀释为500 ng/L,进行 qPC 扩增。将 Ct 值带入已建立的定量标准曲线,计算羊肉质量百分比及其回收率,16S rDNA 作为内参,每个样品做3 个重复,检验标准曲线的准确性。1310检测方法的稳定性评估。取终浓度分别为 4000、800、32 pg/L 的貉 DNA 样本,以其为模板进行 qPC 扩增,分别进行组内及组间重复性试验。每个浓度重复检测 3次,记录各浓度在检测体系的 Ct 值,并计算其变异系数,以评估检测方法的稳定性和重复性。2结果与分析21DNA 浓度和纯度测定不同肉类 DNA 浓度和纯度测定结果见表 2。按核酸
16、提取要求,无蛋白质污染的核酸溶液A260/A28018,无碳水化合物污染的核酸溶液 A260/A23020。测定结果(表 2)显示,提取的各类肉 DNA 纯度和浓度均达到要求,模板 DNA 质量较好,无蛋白及杂质污染,可用于后续 qPC 检测。表 2DNA 浓度和纯度测定结果Table 2Determination results of DNA concentration and purity肉类Meat type浓度 Conce-ntrationng/LA260/A280A260/A230猪 Pig6808185236牛 Cattle5664192205貉 accoon dog6971197
17、202羊 Sheep5875198231鸡 Chicken6600183231鸭 Duck4884193216貂 Mink5370189213狐狸 Fox5334184236不同肉类基因组 DNA 电泳检测结果如图 1 所示。电泳条带清晰、完整,说明提取的基因组 DNA 可用于后续 qPC检测。注:M 为 mark。图 1各种肉类基因组 DNA 提取结果电泳图Fig1Electrophoretogram of genomic DNA extraction results ofvarious meats22引物 cytB 特异性及 16S 通用性检测结果以 cytB 作为特异性引物,分别以猪、牛
18、、羊、鸡、鸭、貉、狐狸和貂基因组DNA 为模板进行 qPC 扩增。如图 2 所示,8 种畜禽肉中,只有貉肉 DNA 在第 17 个循环处开始进入指数扩增期,而其余6 种在第 27 个循环处才开始进入指数扩增期,可以很好地与其他几个常见物种区分,表明 cytB 引物特异性较强,符合试验要求。图 2特异引物 cytB 对不同肉类 DNA 的扩增曲线Fig2Amplification curves of specific primer cytB on differentmeat DNA内参引物 16S 对 8 种畜禽肉均有较好的扩增效率,且内081安徽农业科学2023 年参基因 16S rDNA 检
19、测的 Ct 值均集中在狭窄范围内,较为稳定(图 3),表明其具有通用性。图 3内参引物 16S 对不同物种肉 DNA 的扩增曲线Fig3Amplification curve of meat DNA of different species byinternal reference primer 16S图 4 分别为特异性引物和通用引物的扩增熔解曲线,特异性引物扩增熔解曲线峰值温度为8565,通用引物峰值温度为8425,2 个熔解曲线均为规则特异性单峰,无杂峰,说明试验所用 2 个引物均无二聚体产生且特异性较强,符合检测要求。23引物灵敏度检测以不同浓度貉基因组 DNA 为模板进行 qPC 检
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