一种新型海洋胶原蛋白复合水凝胶的制备及评价_伍乐.pdf
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1、第3 6卷 第5期高分子通报V o l.3 6,N o.52 0 2 3年5月P O L YME R B U L L E T I NM a y,2 0 2 3收稿:2 0 2 2-0 8-1 0;修回:2 0 2 2-0 9-1 5基金项目:国家自然科学基金项目(2 0 9 7 6 0 6 8)作者简介:伍乐(1 9 9 7-),女,硕士,暨南大学生命科学技术学院生物与医药专业*通讯联系人:段书霞,高级工程师。E-m a i l:d u a n s xy a d u g r o u p.c o m,T e l:1 3 7 8 1 9 5 2 9 9 9;敖宁建,研究员,博(硕)生导师,研究方向
2、为新型医用高分子材料与医疗器械产品的研发。E-m a i l:t a o n j j n u.e d u.c n,T e l:1 3 6 6 0 5 9 6 7 6 6本文附有电子支持信息,与本文一并刊登在w ww.g f z t b.c o md o i:1 0.1 4 0 2 8/j.c n k i.1 0 0 3-3 7 2 6.2 0 2 3.0 5.0 0 9研究论文一种新型海洋胶原蛋白复合水凝胶的制备及评价伍乐1,3,李艳艳1,付迎坤3,4,潘红福3,常聪3,郑自琪3,张正男3,4,李日旺1,段书霞3,4*,敖宁建1,2*(1.暨南大学生命科学技术学院,广州 5 1 0 6 3 2
3、;2.广东省教育厅生物材料重点实验室,广州 5 1 0 6 3 2;3.河南亚都实业有限公司,新乡 4 5 3 0 0 0;4.河南省医用防护用品重点实验室,新乡 4 5 3 0 0 0)摘要:海星具有很强的再生能力,体壁中含有丰富的胶原蛋白(S S C)。以甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA)和甲基丙烯酸化胶原蛋白(S S CMA)为原料,复合海洋源小球藻生长因子(C G F),采用紫外光交联法制备复合水凝胶,并对复合水凝胶的力学性能、溶胀性、降解性能、微观结构进行分析,同时验证了复合水凝胶对细胞的毒性及增殖作用。通过扫描电镜观察到S S CMA/HAMA/C G F复合水凝胶具有明显的孔状结构
4、,随着HAMA比例的增加,水凝胶的力学性能也得到了提高。当HAMA的添加量为6 0%时,复合水凝胶在2 4 h内的溶胀率最大,可达到 其 自 身 重 量 的5倍 左 右。经 过3 0天,S S CMA/HAMA/C G F-7 5发 生 最 大 量 的 降 解。S S CMA/HAMA/C G F复合水凝胶对小鼠表皮成纤维细胞(L 9 2 9)无毒副作用,表现出良好的细胞相容性,且对小鼠胚胎成纤维细胞(N I H-3 T 3)具 有 明 显 的 增 殖 作 用,其 中S S CMA/HAMA/C G F-6 0对 细 胞 的 增 殖 率 最 大,可 达1 2 9.7 0%。关键词:海星壳胶原蛋
5、白;透明质酸;光交联;水凝胶;细胞毒性P r e p a r a t i o n a n d E v a l u a t i o n o f U V C r o s s-l i n k e d M a r i n e C o l l a g e n/H y a l u r o n i c A c i d C o m p o s i t e H y d r o g e lWU Y u e1,3,L I Y a n-y a n1,F U Y i n g-k u n3,4,P AN H o n g-f u3,CHAN G C o n g3,Z HE N G Z i-q i3,Z HAN G Z h
6、e n g-n a n3,4,L I R i-w a n g1,DUAN S h u-x i a3,4*,AO N i n g-j i a n1,2*(1.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,J i n a n U n i v e r s i t y,G u a n g z h o u 5 1 0 6 3 2,C h i n a;2.K e y L a b o r a t o r y o f B i o m a t e r i a l s,E d u c a t i o n D e p a r t
7、m e n t o f G u a n g d o n g P r o v i n c e,G u a n g z h o u 5 1 0 6 3 2,C h i n a;3.H e n a n Y a d u I n d u s t r i a l C o.L t d.,X i n x i a n g 4 5 3 0 0 0,C h i n a;4.K e y L a b o r a t o r y o f M e d i c a l P r o t e c t i v e E q u i p m e n t,H e n a n P r o v i n c e,X i n x i a n g
8、 4 5 3 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:S t a r f i s h h a v e s t r o n g r e g e n e r a t i v e a b i l i t i e s a n d a r e r i c h i n c o l l a g e n(S S C)i n t h e i r b o d y w a l l s.U s i n g m e t h a c r y l a t e d h y a l u r o n i c a c i d(HAMA)a n d m e t h a c r y l a t e d c o
9、l l a g e n(S S CMA)a s r a w m a t e r i a l s,c o m b i n e d w i t h m a r i n e s o u r c e C h l o r e l l a g r o w t h f a c t o r(C G F),t h e c o m p o s i t e h y d r o g e l w a s p r e p a r e d b y u l t r a v i o l e t c r o s s-l i n k i n g m e t h o d,a n d t h e m e c h a n i c a l
10、 p r o p e r t i e s,s w e l l i n g p r o p e r t i e s,d e g r a d a t i o n p r o p e r t i e s a n d m i c r o s t r u c t u r e o f t h e c o m p o s i t e h y d r o g e l s w e r e a n a l y z e d,a n d t h e t o x i c i t y a n d p r o l i f e r a t i o n e f f e c t s o f t h e c o m p o s i
11、 t e h y d r o g e l s o n c e l l s w e r e a l s o v e r i f i e d.T h e S S CMA/HAMA/C G F c o m p o s i t e h y d r o g e l s w e r e o b s e r v e d b y s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s-5期伍乐等:一种新型海洋胶原蛋白复合水凝胶的制备及评价c o p y t o h a v e a n o b v i o u s p o r e-l i k e s t r u c t u r e
12、,a n d t h e m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f t h e h y d r o g e l s w e r e a l s o i m p r o v e d w i t h t h e i n c r e a s e o f t h e HAMA r a t i o.Wh e n t h e a d d i t i o n a m o u n t o f HAMA i s 6 0%,t h e s w e l l i n g r a t e o f t h e c o m p o s i t e h y d r o g e l
13、 w i t h i n 2 4 h i s t h e l a r g e s t,w h i c h c a n r e a c h a b o u t 5 t i m e s o f i t s o w n w e i g h t.A f t e r 3 0 d a y s o f d e g r a d a t i o n,S S CMA/HAMA/C G F-7 5 u n d e r g o e s t h e g r e a t e s t a m o u n t o f d e g r a d a t i o n.S S CMA/HAMA/C G F c o m p o s i
14、 t e h y d r o g e l h a s n o t o x i c a n d s i d e e f f e c t s o n m o u s e e p i d e r m a l f i b r o b l a s t s(L 9 2 9),s h o w s g o o d c y t o c o m-p a t i b i l i t y,a n d h a s o b v i o u s p r o l i f e r a t i o n e f f e c t o n m o u s e e m b r y o n i c f i b r o b l a s t
15、s(N I H-3 T 3),a m o n g w h i c h S S CMA/HAMA/C G F-6 0 h a d t h e h i g h e s t c e l l p r o l i f e r a t i o n r a t e,r e a c h i n g 1 2 9.7 0%.K e y w o r d s:S t a r f i s h s h e l l c o l l a g e n;H y a l u r o n i c a c i d;P h o t o c r o s s l i n k i n g;H y d r o g e l;C y t o t o
16、 x i c i t y 皮肤是人体面积最大的器官,也是人体抵御外部刺激的第一道防线13,在解剖学方面,皮肤由三个不同的层组成:无血管表皮、高度血管化的较厚真皮和血管化良好的皮下组织47。体外皮肤损伤,如烧伤、冻伤等以及各种皮肤病或其他疾病都会导致皮肤大面积损伤,治疗需要大量的皮肤源81 0。科学家认为,皮肤损伤的关键问题在于找到合适的皮肤替代物。皮肤替代物可以分为传统皮肤替代物和组织工程皮肤1 1,1 2。传统皮肤替代物主要包括同种人工合成膜、同种异体皮和异种皮,由于这些皮肤替代物存在自体皮皮源不足、异种皮免疫原性及传染病等缺点,因此组织工程皮肤成为众多科学家研究的重点之一。基于对皮肤的大量
17、需求和伦理等各方面的考虑,开发一种用于皮肤再生、快速促进伤口愈合,且具有良好的生物相容性和低免疫原性的组织工程皮肤敷料具有很大的科学研究价值和临床应用价值1 3。组织工程皮肤由支架材料、细胞和生长因子组成。支架材料主要包括天然生物支架材料、合成生物支架材料和复合支架。天然生物支架材料具有无毒、可降解等优点,但单一的材料无法同时满足力学强度和生物相容性的要求1 4;人工合成生物材料可提高细胞对支架的粘附力和稳定材料的降解速率,但在降解的同时会产生一些酸性物质,对细胞造成损伤1 5。因此,综合天然生物支架材料和合成生物支架材料各自的优点,制备出了一类复合材料。这种复合材料可以是多种合成材料复合而成
18、,如基于聚谷氨酸修饰的纳米晶纤维素填充聚己内酯(P C L)的新型骨组织再生三维打印支架(P G l u-N C C)1 6;也可以是天然生物材料与合成生物材料复合而成,如L-谷氨酸(L GA)负载的胶原蛋白/壳聚糖(C o l-C S)复合支架,用于加速糖尿病伤口的愈合1 7。目前研究较多的复合材料主要是由天然生物材料和人工合成材料共同制备而成的一类组织工程皮肤。天然生物材料主要包括胶原蛋白、壳聚糖、海藻酸、透明质酸等1 8。胶原蛋白(c o l l a g e n,C o l)作为人体皮肤的主要组成成分1 9,在维持人类皮肤的弹性和韧性的同时还具有支撑和保护的作用,此外还主动参与细胞的迁移
19、、分化和增殖代谢,具有良好的生物相容性2 0,因此胶原蛋白在组织工程皮肤领域中有非常广阔的应用前景。目前主要用于生物医用材料研究的胶原蛋白多来自于猪皮、牛跟腱等陆生动物,但此类陆生胶原具有一定的传染病风险,因此对胶原蛋白的研究重心逐渐转到了海洋生物方面2 1,2 2。海星作为一种繁殖能力和再生能力强的海洋生物,体壁中含有丰富的胶原蛋白,可促进肉芽组织生成,加速创面的愈合2 3。海星壳胶原蛋白(s t a r f i s h s h e l l c o l l a g e n,S S C)相较于陆生动物源胶原蛋白不仅具有无传染病风险、低免疫原性等优势,而且还可以促进纤维细胞、血管皮细胞的分化并形
20、成基质,激活巨噬细胞的吞噬能力,从而提高机体的免疫活性,降低创面被感染的机会2 4。透明质酸(h y a l u r o n i c a c i d,H A)是存在于创面上最主要的氨基葡萄糖,具有良好的保湿性、润滑性、粘弹性及非免疫原性,因此H A在临床医学及生物医学工程领域受到广泛关注2 5,如Z h a o等2 6利用偶氮苯和与透明质酸链共轭的-环糊精基团之间的主客体相互作用形成了光响应性超分子多糖水凝胶,不仅能发挥构造作用,还具有调节功能,同时能够刺激伤口部位的血管生成,加速溃疡创面愈合2 7,2 8。此外,有研究发现2 9当伤口处含有丰富的透明质酸时,通常在伤口愈合后不会留下疤痕,这为
21、皮肤创面无痕修复的研究方向提供了新的思路。但由于透明质酸存在稳定性差、易发生降解、对透明质酸酶敏感3 0,受到强酸、强碱、热等刺激时易发生变性,失去其生理功能等缺点,因此通常在使用时会对它进行改性,如酯化、开环、接枝等各种化学改性方法,以得到性能更好的透明质酸衍生物。136高分子通报2 0 2 3年小球藻是存在于海洋中的一类普生性单细胞绿藻,是2 0亿年前出现在地球上最早的真核细胞生物,它含有多种生物活性物质,其中小球藻的生长因子(c h l o r e l l a g r o w t h f a c t o r,C G F)是决定其每2 0 h就可以增长4倍的关键3 1,没有任何一种生物能达
22、到这样高的增长速率,因此将这种生长因子用于皮肤创面修复研究具有重大意义。C G F是海洋生物绿藻独有的活性成分,据报道C G F不仅具有促进正常细胞增殖、增强机体免疫等多种生物活性3 2,还可以激活淋巴细胞,增强机体免疫力,活化人体细胞,使生长发育加快,促进人体受伤组织修复3 3,3 4。有研究证明,C G F能够提高正常细胞再生能力达2 5%以上,可以产生更优质的细胞。目前水凝胶的交联方法主要包括物理交联(如离子交联、热凝胶等)和化学交联(如点击化学、M i c h a e l加 成3 5、席 夫 碱 反 应3 6,3 7、光 交 联等)。与物理交联水凝胶相比,化学交联形成的水凝胶显示出了更
23、好的机械强度和凝胶行为。光交联水凝胶是指在紫外光、蓝光或可见光的照射下,含有光敏基团的物质通过分子内或分子间交联形成的三维网络结构材料3 8。相比于其他触发(如改变p H、改变温度等)或自发(如环氧-胺反应、硫醇-烯/炔反应等)的交联方式,光引发交联具有非物理接触、时空精准可控、反应条件温和、副产物少等优势3 9。光交联水凝胶包括可聚合材料、光引发剂和光源三部分反应体系。通常采用含甲基丙烯酸酯的聚合物对材料进行改性使其获得可发生光交联的光敏基团4 0,4 1。由于制备光交联水凝胶需要以双键或巯基作为交联前提,因 此本课题将 通过甲基丙 烯酸酐(MA)分别对海星壳胶原蛋白(S S C)和透明质酸
24、(HA)进行改性,以引入活性双键,同时添加生长因子C G F,采 用 紫 外 光 交 联 法 制 备S S CMA/HAMA/C G F复合水凝胶,探究复合水凝胶的理化性能和生物学性能,以此得到一种可抑制伤口感染,促进伤口快速愈合的复合水凝胶。1 实验方法 1.1 实验试剂 透明质酸(HA)、胃蛋白酶,上海麦克林生化科技有限公司;海星,山东烟台海生海鲜有限公司;氢氧化钠,西陇科学股份有限公司;冰乙酸,广州东巨 有 限 公 司;聚 乙 二 醇 二 丙 烯 酸 酯(P E G-D A),深圳市文乐生物科技有限公司;甲基丙烯酸酐,上海麦克林生化科技有限公司;光引发剂(2-羟基-2-甲基-1-4-(2
25、-羟 基 乙 氧 基)苯 基-1-丙 酮,I 2 9 5 9),北京沃凯生物科技有限公司;C C K-8试剂盒,广州捷威斯生物科技有限公司;L 9 2 9细胞、N I H-3 T 3细胞,中科院细胞库;胎牛血清,G i b c o;DMEM培养基,广州先度生物科技有限公司。1.2 实验仪器 磁力搅拌器(S Z C L-3 B),I KA,德国;电子天平(F A 1 1 0 4),上海一恒科技有限公司;冷冻干燥机(A L P HA 1-4/2-4/L S C),德 国CHR I S T;离 心 机(KA-1 0 0 0),上海安亭科学仪器厂;场发射扫描电子显微镜(TM 3 0 3 0),日本;紫
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