推拿对神经病理性疼痛大鼠m...、ERK、STAT3的影响_吴娉婷.pdf
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1、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药疼痛研究推拿对神经病理性疼痛大鼠miR-21-5P、ERK、STAT3的影响吴娉婷1,肖易2,梁英业2,谢柳红1,丁瑶1,卢栋明2,陈晓红1,唐宏亮3(1.广西中医药大学 南宁 530000;2.广西中医药大学第一附属医院 南宁 530000;3.广西中医药大学附属防城港医院 防城港 538000)摘要:目的观察在神经病理性疼痛大鼠中miR-21-5P、细胞外调节蛋白激酶(E
2、xtracellular signal-regulated kinases,ERK)和信号转导和转录活化因子3(Signal transducer and activator of transcription3,STAT3)的表达变化,探究推拿镇痛作用的机制。方法40只SD雄性大鼠,按照随机分类的方法将其分为正常组、模型组、假手术组、推拿组和假推拿组5个组,每组8只。不给予正常组任何干预措施;模型组、推拿组及假推组建立L5脊神经结扎模型(SNL);只暴露假手术组的脊神经2-3 min;在造模后第1天使用按摩推拿手法模拟仪对推拿组的“环跳”、“阳陵泉”和“悬钟”穴进行推拿治疗,每天1次,每次治疗
3、18 min(双侧),连续干预7天;假推拿组的大鼠则每天给予双后肢18 min的轻轻抚摸,连续干预7天。各组大鼠的机械痛阈值(Paw withdrawl mechanical threshold,PWMT)和热痛阈值(Hindpaw withdrawal thermal latency,PWTL)在造模前1天、造模后第3天和第7天进行测定。使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q-PCR)检测造模后第7天各组大鼠中miR-21-5P的表达水平;使用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定各组大鼠中ERK、STAT3的蛋白表达水平,酶联免疫吸附法(E
4、nzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠中白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)的表达水平。结果术后第3天和第7天,模型组大鼠的机械阈值与热痛阈值比正常组及假手术组的阈值下降(P0.05),推拿组大鼠的机械阈值与热痛阈值比模型组、假推拿组的阈值升高(P0.05)。术后第7天,q-PCR检测结果显示,模型组大鼠的miR-21-5P水平较正常组及假手术组的miR-21-5P水平显著增加(P0.01),推拿组大鼠的miR-21-5P水平较模型组与假推拿组的miR-21-5P水平显著下降(P0.01);Western blot检测结果显
5、示,与正常组及假手术组比较,模型组大鼠的ERK与STAT3水平显著增加(P0.01),与模型组、假推拿组比较,推拿组能显著下调大鼠ERK(P0.05)与STAT3水平(P0.01);ELISA检测结果显示,模型组大鼠的IL-1水平较正常组及假手术组的表达增加(P0.05),推拿组大鼠的IL-1水平较模型组、假推拿组的表达下调(P0.01)。结论推拿可以减轻SNL大鼠的疼痛反应,其机制可能与调控miR-21-5P、ERK、STAT3、IL-1的表达,从而抑制其介导的炎症反应有关。关键词:推拿 神经病理性疼痛 miR-21-5P ERK STAT3 IL-1 镇痛doi:10.11842/wst.
6、20211009003 中图分类号:R244.1 文献标识码:A 收稿日期:2021-10-09 修回日期:2022-02-28 国家自然科学基金委员会青年科学基金项目(8180151635):从LncBANCR介导ERK/mTOR调控自噬探讨推拿对SNL大鼠的镇痛效应机制,负责人:卢栋明;广西壮族自治区自然科学基金委员会面上项目(2018JJA140664):从miRNA-21的表达调控作用探讨推拿治疗慢性病理性疼痛的效应机制研究,负责人:肖易;广西壮族自治区研究生教育创新计划区级项目(YCSW2021229):从LNCRNAH19调控miR-342-3p/IER3探讨枢经推拿对NPP的镇痛
7、机制研究,负责人:吴娉婷。通讯作者:唐宏亮,教授,副主任医师,硕士研究生导师,主要研究方向:针灸推拿治疗痛症的基础及临床研究。4393 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NPP)是由躯体感官神经系统的病变或疾病引起的疼痛,流行病学研究的系统回顾报道神经病理性疼痛的患病率为6.9-10%1。由于NPP拥有极其复杂的的病理生理学,NPP也被
8、认为是目前神经原性疼痛综合征临床治疗的主要挑战2。尽管国内外在NPP的发病机制和治疗方面已经取得了巨大的进展,但目前治疗这一疾病的方法包括药物干预(三环类抗抑郁药、曲马多以及低剂量的阿片类药物等)、物理疗法和脊髓刺激等,其中药物干预容易诱导强迫性滥用,而物理疗法和脊髓刺激的效果有限且适用性不广。因此深入探索疼痛的发病机制,寻找疼痛治疗靶点,对提高疼痛治疗效果有着深远的意义。MicroRNAs3越来越被认为是免疫和神经元基因表达的调节因子,是NPP病理生理学的潜在主开关。且越来越多的证据强调,神经病理性疼痛的诱导和维持伴随着MicroRNAs表达的变化,而这些MicroRNAs表达的变化似乎与神
9、经损伤、痛觉过敏和神经可塑性相关4。最近的研究表明5miR-21在神经病理性疼痛晚期损伤的背根神经节(Dorsal root ganglia,DRG)神经元增加,而阻断 miR-21 可以缓解神经病理性疼痛。与此同时研究显示6miR-21-5P在DRG神经元中高表达,而鞘内注射miR-21-5P拮抗剂可以降低神经病理性疼痛的超敏反应和炎症巨噬细胞在DRG中的募集程度。但 miR-21-5P 在脊髓背角的表达尚不明确。本团队的前期研究已经反复印证了推拿的镇痛作用7-8,也从神经传递角度阐明了推拿的镇痛机制9-10。但其机制尚未完全阐述清楚,还有待进一步研究。因此本实验从微小RNA角度出发阐明神经
10、病理性疼痛在脊髓背角当中的发病机制以及推拿的镇痛机制,为完善推拿治疗NPP的效应研究提供研究依据。1 材料与仪器 1.1实验动物40只健康雄性SD大鼠,SPF级,体重210-240 g,月龄为6周。由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号:SCXK(湘)2019-0004。大鼠饲养在广西中医药防治医学分子生物实验室动物房中,湿度恒定,室温18-20,按时更换垫料以及给予饲料、饮水,适应性喂养7天。本实验研究过程符合广西中医药大学第一附属医院动物使用及伦理委员会审查。1.2主要试剂及仪器microRNA 反 转 录 试 剂 盒(TaKaRa),TB Green PCR 荧光试剂(TaKaR
11、a),抗 STAT3 抗体(PTG),抗ERK抗体(PTG),蛋白定量试剂盒(BCA法)(碧云天),IL-1 ELISA 试剂盒(赛默飞),Thermo Scientific Piko Real 96 PCR仪(赛默飞公司,美国),Bio-Rad Powerpac HC 电泳仪及 ChemiDoc MP Touch Hot 图像扫描仪(Bio-Rad公司,美国),电子von Frey 2393及热板痛觉测试仪(IITC公司,美国),酶标仪(Thermo,美国)。2 方法 2.1动物分组将 40 只 SD 雄性大鼠随机分为 5 组:正常组(n=8)、假手术组(n=8)、模型组(n=8),假推拿组
12、(n=8)、推拿组(n=8)。2.2造模方法参照课题组前期研究11,模型组、推拿组和假推拿组建立大鼠L5脊神经结扎(SNL)模型。按照3 mLkg-1的大鼠体重配置10%的水合氯醛进行腹腔麻醉后,定位每只大鼠的左侧后上棘,剃除该部位及周边的毛发备皮。常规消毒后于后上棘左侧与脊柱垂直切开,约2 cm 长,与脊柱平行。分离左侧棘旁的筋膜和肌肉后,显露脊柱。用小咬钳去除 L5横突,暴露 L5 脊神经,用5-0可吸收缝线将神经结扎,仅单侧结扎。假手术组仅暴露L5脊神经2-3 min,不结扎。最后用生理盐水清洗手术创口,并给予碘伏消毒,逐层关闭伤口。缝合伤口后将大鼠放入笼中观察,直至麻醉恢复,以免窒息导
13、致死亡。造模成功的标准为术后大鼠患侧出现跛行、撤足、抬足。2.3干预方法推拿组选择足少阳胆经上的“环跳”、“阳陵泉”和“悬钟”三个穴进行干预。干预时用布袋将大鼠束缚防止挣扎,然后使用按摩推拿手法模拟仪(中国人民共和国发明专利号:ZL 200710187403.1)从造模后第1天开始进行推拿治疗。按摩推拿手法模拟仪按摩头选用直径10 mm的圆形光滑接触面,刺激力量为4 N,手法模拟点法、揉法和拨法。每天1次,每次每穴每法1 min,每侧共9 min,每次治疗18 min(双侧),连续干预7天;假推拿组的大鼠同样用布袋束缚防止挣扎,每天给予双后肢18 min的轻轻抚摸,连续干预7天。正常组、模型组
14、以及假手术组只观察7天,不做任何干预处理。4394 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药疼痛研究2.4观察指标2.4.1大鼠患侧机械痛阈值(PWMT)的测定将大鼠提前放入铁笼中适应环境,当大鼠停止自我梳理和探索活动时选用4 g、6 g、8 g、10 g、15 g、26 g、60 g、100 g的von-Frey纤维丝依次从铁笼底部伸进去刺激大鼠的患侧足,当大鼠出现抬足或舔趾等阳性反应行为时,记录所对应的纤维丝的刺
15、激强度。连续测3次,每次测量间隔15 s,取平均值即为机械痛阈值。于术前第1天及术后第3、7天进行PWMT测量。2.4.2大鼠患侧热痛阈值(PWTL)的测定按Hargreaves12法测定。当测试仪达到预设温度52.5时,将大鼠按组别依次放进测试仪的有机玻璃动物笼内,等大鼠停止自我梳理和探索活动时按下计时器,当大鼠患侧足出现舔足、回缩或跳跃时测试仪上显示的时间即为大鼠热痛阈值(PWTL)。在没有反应的情况下,在30 s时将大鼠从热板上取出,以避免组织损伤。每只大鼠测量3次,每次测量时间隔5 min,取平均值作为热痛阈值。于术前第1天及术后第3、7天进行PWTL测量。2.4.3蛋白免疫印迹使用蛋
16、白免疫印迹法检测干预7天后的大鼠脊髓(L4-6)中 ERK、STAT3 的蛋白相对表达量。按照每100 mg组织加入1 mL蛋白裂解液的方法取L4-6段脊髓放入蛋白裂解液中进行低温匀浆,4 12 000 rpm离心10 min,取上清液。各样本蛋白浓度使用BCA蛋白浓度试剂盒测定。用SDS-PAGE分离蛋白,转膜。5%脱脂奶粉封膜1 h,加入稀释后的抗体(STAT3一抗,1 1000;ERK一抗,1 1000),放置4冰箱孵育过夜。清洗后孵育二抗(1 5000)1 h。滴加ECL溶液,使用Bio-Rad ChemiDoc MP Touch Hot 图像扫描仪采集图像。使用Image J软件分析
17、图像结果。2.4.4酶联免疫吸附使用酶联免疫吸附法检测干预7天后的大鼠血清中IL-1含量,所有操作步骤按照试剂盒的操作说明进行。终止反应后,立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。2.4.5荧光定量PCR使用荧光定量PCR法检测干预7天后的大鼠脊髓(L4-6)中miR-21-5P mRNA表达。用Trizol试剂提取总RNA,然后按照PCR产品试剂盒的操作说明进行实验。miR-21-5P、-actin 基因序列引物由 TaKaRa 公司提供,引物序列见表1。反应条件:95 30 s;95 5 s,60 30 s,45 个循环;95 5 s,60 1 min,95;50 30
18、s。将所得Ct值按照2ct方法进行数据处理。2.5统计学分析数据采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析,结果以均数标准差(x s)表示。数据符合正态分布,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较,方差齐者用LSD检验,方差不齐者用Tamhane s T2检验。不符合正态分布的数据采用秩和检验。以P0.05为差异有统计学意义。3 结果 3.1各组大鼠的PWMT比较术前各组大鼠的机械痛阈值无显著差异。术后第3天,机械痛阈值结果显示模型组、假手术组、假推拿组和推拿组较正常组相比均下降,模型组较假手术组下降(P0.05),且正常组及假手术组显著高于模型组,数据显示正常组为(54.005.07)、
19、假手术组为(38.878.54)、模型组为(12.751.66);与模型组、假推拿组相比,推拿组的机械痛阈值升高(P0.05),且推拿 组 显 著 高 于 模 型 组 为(39.378.07)、假 推 组 为(22.375.04)。术后第7天,结果显示模型组与假推组的机械痛阈值较正常组降低,模型组的机械阈值较假手术组降低(P0.05),且发现大鼠模型组的机械痛阈值为(16.502.87),推拿组的机械痛阈值为(45.878.11),推拿组和模型组相比痛阈明显提高(P0.05),提示推拿有助于缓解SNL大鼠的疼痛,且能恢复SNL大鼠的痛阈。如表2,图1所示。3.2各组大鼠的PWTL比较术前各组大
20、鼠的热痛阈值无显著差异。术后第3天,热痛阈值结果显示模型组、假手术组、假推拿组和推拿组较正常组相比均下降,模型组较假手术组下降(P0.05),且正常组及假手术组显著高于模型组,数据显示正常组为(27.095.80)、假手术组为(21.641.54)、模型组为(12.201.36);与模型组、假推拿组相比,推拿组的热痛阈值升高(P0.05),且推拿组显著表1荧光定量PCR的引物序列引物名称miR-21-5P单链-actin上游-actin下游引物序列5-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-35-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-35-GACTCATCGTACTCCTGCT
21、TGCTG-34395 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 高于模型组为(23.010.98)、假推组为(16.731.81)。术后第7天,结果显示模型组与假推组的热痛阈值较正常组降低,模型组的机械阈值较假手术组降低(P0.05),且发现大鼠模型组的热痛阈值为(16.431.27),推拿组的热痛阈值为(27.982.19),推拿组与模型组相比对热刺激的耐受明显提高(P0.05),提示推拿
22、有助于缓解SNL大鼠的疼痛,且能提高大鼠对热刺激的阈值。如表3,图2所示。3.3各组大鼠脊髓背角中miR-21-5P mRNA表达的比较术后第7天,模型组脊髓miR-21-5P mRNA的表达相较于正常组及假手术的表达升高(P0.01),且推拿组miR-21-5P mRNA的表达较模型组显著下降(P0.01)。如表4,图3所示。3.4各组大鼠脊髓背角中ERK、STAT3蛋白表达的比较术后第7天,模型组脊髓背角ERK、STAT3的表达相较于正常组及假手术组的表达升高(P0.01)。经推拿干预后,推拿组的ERK表达下降,与模型组相比表达差异明显(P0.05),推拿组的STAT3表达同样下降,与模型
23、组相比差异具有显著性(P0.01)。如图4所示。表3推拿对NPP大鼠热痛阈值的影响(x s,g,n=8)组别正常组模型组假手术组推拿组假推组术前1天29.061.2930.501.7830.341.1930.441.6729.551.59术后3天27.095.8012.201.36*#21.641.54*23.010.98*16.731.81*术后7天27.267.4816.431.27*#28.341.2927.982.1920.422.70*注:与正常组比较,*P0.05;与假手术组比较,#P0.05;与模型组和假推拿组比较,P0.05。图2推拿对NPP大鼠热痛阈值的影响注:与正常组比较,
24、*P0.05;与假手术组比较,#P0.05;与模型组和假推拿组比较,P0.05。表2推拿对NPP大鼠机械痛阈值的影响(x s,g,n=8)组别正常组模型组假手术组推拿组假推组术前1天52.876.9750.758.3251.007.3253.627.550.375.62术后3天54.005.0712.751.66#*38.878.54#39.378.07#+22.375.04#术后7天52.125.2716.502.87#*44.256.1145.878.11+26.004.34#注:与正常组比较,#P0.05;与假手术组比较,*P0.05;与模型组和假推拿组比较,+P0.05。图1推拿对NP
25、P大鼠机械痛阈值的影响注:与正常组比较,#P0.05;与假手术组比较,*P0.05;与模型组和假推拿组比较,+P0.05。表4推拿对NPP大鼠脊髓组织中miR-21-5P mRNA表达的影响(x s,2ct,n=8)组别正常组模型组假手术组推拿组假推组miR-21-5P表达水平1.000.006.531.122.470.801.100.411.830.57注:与正常组及假手术组比较,P0.01;与模型组比较,P0.01。图3推拿对NPP大鼠脊髓组织中miR-21-5P mRNA表达的影响注:与正常组及假手术组比较,P 0.01;与模型组比较,P 0.01。4396 Modernization
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