三种多酚对羟自由基氧化花生球蛋白的影响_沈明娟.pdf
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1、研究报告 年第 卷第 期(总第 期):引用格式:沈明娟,尹可宏,杨曦,等 三种多酚对羟自由基氧化花生球蛋白的影响 食品与发酵工业,():,():三种多酚对羟自由基氧化花生球蛋白的影响沈明娟,尹可宏,杨曦,王振兴,孙健,张雪春,(西南林业大学 生命科学学院,云南 昆明,)(广西农业科学院农产品加工研究所,广西 南宁,)摘 要 为探究 种多酚对羟自由基氧化花生球蛋白的干预作用,通过建立羟自由基氧化体系,采用不同浓度梯度的儿茶素、绿原酸、杨梅素进行干预,分析花生球蛋白的羰基、游离氨基、浊度、紫外可见、荧光光谱及二级结构等变化规律。结果表明,不同浓度的 种多酚对羟自由基氧化花生球蛋白均有一定的抑制作用
2、,其中 的儿茶素可使羟自由基氧化花生球蛋白的羰基含量下降,内源荧光最大波长发生红移,的儿茶素使游离氨基上升,二级结构中无规则卷曲含量下降;杨梅素可使花生球蛋白浊度降低 ;绿原酸使蛋白的 螺旋含量和最大紫外吸光值上升。综上,种多酚的干预可减少或缓解羟自由基对花生球蛋白的氧化损伤,进而影响其结构和性质,其中儿茶素的氧化抑制效果最好。该研究可为花生蛋白的氧化研究和进一步加工利用提供科学依据。关键词 多酚;花生球蛋白;羟自由基氧化;结构第一作者:硕士研究生(孙健研究员和张雪春副教授为共同通信作者,:;)基金项目:国家自然科学基金项目();云南省重大基础专项生物资源数字化开发应用项目()收稿日期:,改回
3、日期:花生()又名“长生果”,在我国广泛种植,且产量丰富,是我国食用最多的坚果之一。花生是良好的蛋白质来源,其中含量最高的是花生球蛋白,占总蛋白的 。研究表明花生球蛋白具有较好的乳化性、起泡性、吸水性和凝胶性等功能特性,可作为一种优良原料广泛应用于食品领域。蛋白质易受到活性氧等外界的影响而发生氧化变质,其中羟自由基是一种氧化能力最强的自由基,对细胞有高度的损伤性,也是引起蛋白质氧化的主要自由基之一。研究发现,多酚的干预可抑制蛋白质的 氧 化 修 饰,改 善 蛋 白 质 的 功 能 特 性。如研究表明植物多酚(儿茶素、咖啡酸、绿原酸、迷迭香)可通过清除自由基的方式来抑制牛肉馅饼和炸丸子中蛋白质的
4、氧化修饰;焦铭发现在儿茶素的干预下,脂肪氧合酶催化亚油酸诱导大豆伴球蛋白氧化作用机理发生改变。上述报道主要针对多酚干预自由基氧化动物蛋白、大豆蛋白的作用解释,对于多酚干预花生球蛋白的相关研究鲜有报道。由于不同种类的多酚和蛋白质的性质、结构不一,其干预效果也不尽相同,因此,多酚对自由基氧化花生球蛋白的干预作用有待进一步探讨。本研究以花生球蛋白为研究对象,通过铁 过氧化氢 抗坏血酸的氧化还原反应产生羟自由基,建立羟自由基氧化体系,对花生球蛋白进行模型氧化,采用杨梅素、儿茶素、绿原酸 种多酚对氧化体系进行干预,分析其氧化程度及结构的变化规律,从而探究多酚对羟自由基氧化花生球蛋白的影响,为花生蛋白的氧
5、化抑制研究提供一些理论依据。材料与方法 材料与试剂云南红皮小花生,云南省昆明市;抗坏血酸(,)、乙二胺四乙酸(,)、,二硝基苯肼(,)、邻苯二甲醛(,)、十二烷基硫酸钠(,)、巯基乙醇等,均为国产分析纯,北京索莱宝科技有限公司;牛血清蛋白标准品、儿茶素(,纯度)、绿原酸(,纯度)、杨梅素(,纯度),上海源叶生物科技有限公司。仪器与设备 多功能小型高速粉碎机,德喜电器技术有限公司;型多功能高速冷冻离心机,德国 公司;酶标仪,美食品与发酵工业 ()国 公司;紫外可见分光光度计,苏州岛津;荧光分光光度计、傅里叶红外光谱仪,美国赛默飞世尔科技公司。实验方法 花生球蛋白的制备根据尹可宏等方法略做修改,花
6、生仁经脱脂后,按料液比 ()分散于 的 缓冲液中,搅拌 后,条件下离心 ,取上清液加入 亚硫酸氢钠,并以 将 调至 ,于 过夜贮存,同等条件下离心,弃上清液,取沉淀,用去离子水洗至中性,冻干后备用。多酚干预羟自由基氧化体系建立参照尹可宏等和曹云刚的方法略做修改,建立多酚干预羟自由基氧化体系。配制质量浓度为 的 蛋 白 液,将 蛋 白 粉 溶 于 的磷酸缓冲液后加入 和,固定体系中二者终浓度为 ,再向其分别添加不同量的儿茶素、绿原酸、杨梅素(、),摇床中孵育 后,添加浓度为 的制备羟自由基氧化体系对其进行氧化修饰,水浴恒温氧化 后加入 终止氧化。透析、冻干备用。以冻干的花生球蛋白粉溶于磷酸缓冲液
7、为模型组,在羟自由基氧化体系中氧化的花生球蛋白为氧化模型组。羰基含量的测定参照 等方法略作改动,采用 显色法 测 定。用 缓 冲 液 配 制 的蛋白液,与 在黑暗环境下反应后,添加三氯乙酸使其沉淀,用(体积分数)乙醇和乙酸乙酯按 (体积比)混合洗涤沉淀后加入 盐酸胍溶液在 下溶解,离心后取上清液在 处测吸光值,采用考马斯亮蓝法测定每组溶液的蛋白浓度,以 ()消光系数计算每毫克蛋白的羰基含量()。羰基含量计算如公式()所示:羰基含量()(对照)()式中:,上清液吸光值;对照,上清液对照组吸光值;,比色半径,;,蛋白质量浓度,。游离氨基的测定参照 等采用 法略作改动测定游离氨基含量。用 缓冲液配制
8、 的蛋白液,另外准确称取 的 溶解于 的乙醇中,加入质量分数为 的 和浓度为 的硼砂 以及 巯基乙醇,最后用蒸馏水定容到 。测定时,取 试剂于试管中,加入 蛋白样液,混匀后室温下反应 。下测其吸光值,以亮氨酸表示游离氨基含量。蛋白浊度的测定依据 等方法修改测定蛋白浊度。用 缓 冲 液 配 制 质 量 浓 度 为 的蛋白液,离心,吸取上清液 加入酶标板中,以不加蛋白的 缓冲溶液为空白(),在 处测定吸光度,吸光度即为浊度。紫外吸收光谱参照 等方 法 进 行 略 微 调 整。用 磷酸缓冲液配制 的蛋白液,离心 ,取上清液稀释为 ,于 、狭缝 进行紫外扫描。内源荧光的测定样品制备方法同 ,以 为激发
9、波长,发射波长范围为 、狭缝 ,进行荧光扫描。傅里叶红外变换光谱采用李杨等方法略作修改。取冻干蛋白样品粉末与溴化钾按照 (质量比)充分研磨、混匀,在约 压力下加压 ,扫描范围为 ,分辨率 ,波数精度 ,扫描次数 次。利用 软件,在 进行基线校正后,在二阶导数谱基础上采用 分峰拟合,根据二级结构分区计算各区域内子峰面积占总峰面积之比。数据处理与分析所有实验均进行 次重复实验,数据用 处理,用 进行差异显著分析(),作图。结果与分析 多酚对花生球蛋白羰基含量的影响羰基化是蛋白质氧化损伤后最明显的表征之一,因此该指标可作为判定花生球蛋白受羟自由基氧化损伤的程度。如图 所示,羟自由基氧化使花生研究报告
10、 年第 卷第 期(总第 期)球蛋白羰基含量升高,这与尹可宏等实验结果相似,说明花生球蛋白经羟自由基氧化后发生了损伤,使羰基含量升高。多酚的干预使花生球蛋白的羰基含量发生相应的改变。与氧化模型组相比,当 种多酚干预浓度为 时,能显著抑制羟自由基氧化花生球蛋白羰基含量的增加()。儿茶素因含有大量的酚羟基,可作为氢供体与氧化体系中的自由基结合生成活性较低的多酚自由基,减少羰基含量的增加。绿原酸、杨梅素因结构差异,当一定量的酚羟基与蛋白质结合达到饱和后,会通过特定的反应形成更多的自由基,随着二者浓度的继续增加,反而造成羰基含量的升高,促进花生球蛋白氧化的损伤。因此,儿茶素在抑制羰基含量增加的效果比绿原
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